【技術(shù)貼】DNA 純化實(shí)驗(yàn)的幾種常用方法

DNA 純化是分子生物學(xué)研究中經(jīng)常需要用到的一種方法。一般來(lái)說(shuō)，做DNA 純化有3 個(gè)目的：1. 獲得高純度的DNA；2. 濃縮DNA；3. 用DNA做測(cè)序，芯片等生物信息學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)。下面，談一談DNA純化的幾種常用方法。

DNA 純化實(shí)驗(yàn)基本上可以分為 PCR 清潔試劑盒純化法和DNA凝膠回收純化法兩大類。PCR 清潔試劑盒純化法又稱為硅膠膜吸附法。因?yàn)樗脑硎牵汗枘z膜可在高鹽條件下結(jié)合 DNA， 又可在低鹽條件下與DNA分離。而 DNA 溶液中的其他渣渣包括引物、單核苷酸、酶、礦物油、鹽離子等，因?yàn)闆](méi)有 DNA 的這種神特性，所以會(huì)被分離開來(lái)。  

如果你的 PCR 產(chǎn)物得到的是單一條帶，*可以直接純化。那么問(wèn)題來(lái)了。如果發(fā)現(xiàn)有雜帶？怎么辦？有哪些辦法可以提取得更干凈？

那么就誕生了我們的第二種方法：DNA 凝膠回收純化法。這種方法簡(jiǎn)單粗暴有效率，也能純化得比較*?，F(xiàn)在已經(jīng)慢慢地取代了第一種方法，成為了DNA 純化的主流方法。 擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)非特異性條帶，那么在膠回收時(shí)切膠很重要，切膠時(shí)盡量選擇目的基因條帶，可以將目的基因所在的膠的邊緣棄去一些，盡量不要切上含有非特異性帶的膠。切膠之后就是回收了，這里分享個(gè)小竅門，回收可以用酚氯仿。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)過(guò)酶切、回收等步驟后，損失太大。合適的做法是：簡(jiǎn)化步驟、減少核酸在處理過(guò)程中的損失，讓較多量的 PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒片斷進(jìn)入酶連反應(yīng)——以量取勝。DNA 凝膠回收純化法是很粗放型的，但是成功率很高。如果愿意，你可以試試。

大致的做法是：制作 100 μL PCR 產(chǎn)物；酒精沉淀回收 PCR 產(chǎn)物；PCR 產(chǎn)物及載體酶切；跑回收膠；將回收膠上的 PCR 產(chǎn)物和載體片斷切下，回收到一個(gè)試管中；冰凍、碎膠，酚、氯仿 抽提，酒精沉淀；加入8微升水、1 微升連接酶和 1 微升連接 buffer，4 度過(guò)夜；轉(zhuǎn)化涂板。

PCR 產(chǎn)物回收 

1. 制備 100μL PCR 產(chǎn)物。 

2. 將 100μL PCR 產(chǎn)物加入一 1.5mL 離心管中，再加入 400μL 雙蒸水，顛倒混勻。加入 900μL  預(yù)冷無(wú)水乙醇、20μL3M 的醋酸鈉。顛倒數(shù)次混勻。（提示 本方法使用的醋酸鈉量較小，但足夠沉淀核酸，并且無(wú)需洗鹽。） 

3. 4℃靜置 30 分鐘，以利于核酸沉淀。 

4. 12000rpm 4℃ 離心 15 分鐘，沉淀核酸。 

5. 棄上清，將離心管倒置于干凈吸水紙巾上 5 分鐘。室溫下吹風(fēng)干燥。（提示 可將試管置于超凈臺(tái)吹風(fēng)干燥。如果管底有較多液體聚集，可蓋好管蓋后，輕彈管底數(shù)次，將液體分散掛在管壁上，再打開管蓋吹風(fēng)。） 

酶切直接在回收 PCR 產(chǎn)物的試管中配置酶切體系。1%瓊脂糖回收膠回收（碎膠、酚氯仿抽提法）。 

綜上所述，純化的主要目的就是要去除蛋白質(zhì)。而酚氯仿混合液能有效地使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制 RNAase 的活性，酚氯仿還可以減少酚在核酸溶液中的痕量。所以是一種好東西。