如何解決酶切切過頭的問題？

之前談到了酶切切不動(dòng)的問題。這一次，我們探討一下酶切的另外一端：酶切切過頭的問題。還是按照一貫的做法和思路，發(fā)現(xiàn)主要是兩個(gè)原因?qū)е碌?，解決辦法也是有的。

一、酶切時(shí)間過長 

酶切時(shí)間過長的確有時(shí)候會(huì)對(duì)目的條帶有影響，因?yàn)槟阌玫拿缚赡軙?huì)有星號(hào)活性。那么什么叫星號(hào)活性呢？通俗一點(diǎn)講，就是酶不去切它該切的地方，瞎切一氣......酶切時(shí)間過長，會(huì)導(dǎo)致最后亂切。安培建議：雙酶切不要超過 5 小時(shí)。其實(shí)一般 3-4 小時(shí)足夠了。你應(yīng)該有提供給你酶的生物試劑公司的相應(yīng)的說明書的吧？上面都有寫明酶的活性和作用時(shí)間。現(xiàn)在的酶都很不錯(cuò)的，10 到 15 分鐘就可以都切完。一般只水浴一個(gè)小時(shí)，不會(huì)再長了。 如果時(shí)間太長，就會(huì)造成下圖所示的情況。注意第四泳道紅框標(biāo)注的地方。居然切出了 5 根 條帶。這顯然是時(shí)間過長了。

二、酶量過多 

和過長的反應(yīng)時(shí)間會(huì)造成非特異性的酶切（星號(hào)活性）一樣，酶加多了也會(huì)產(chǎn)生星號(hào)活性。一般來說，所加酶的體積不能超過酶切總體積的 1/10，否則甘油濃度會(huì)超過 5%，會(huì)產(chǎn)生星號(hào)活力。在使用高酶量的時(shí)候需要注意甘油的最終濃度不要超過 5%，也就是說 10ul 的體系， 酶的用量不要超過 1ul。

以 TAKARA 的酶為例，其對(duì) 1 單位酶的定義如下：在 50 μl 反應(yīng)液中，30℃溫度下反應(yīng) 1 小 時(shí)，將 1 μg 的 λDNA *分解的酶量定義為 1 個(gè)活性單位(U)。 而該酶濃度約為 15 U/μl。 在除外酶降解的因素外，理論上，該酶可分解 15μg 的 DNA。而一般從 1-4ml 菌液提出的 DNA 約為 3μg，而 PCR 純化后的產(chǎn)物（50 體系）約為 3μg，所以即便全部加進(jìn)去，只要純化的質(zhì)量非常好，酶切也*切得動(dòng)。注意，不要加多了呀。

但是給推薦的一般都是 20 ul 體系加 1ul。 其實(shí)，在 20ul 只加 0.5ul 酶，切的效果也很好。

其實(shí)，除了考慮酶濃度（每 ul 多少個(gè)單位）以外，還應(yīng)該考慮這種酶在 λ DNA 上的酶切位點(diǎn)數(shù)目。比如用 Hinc Ⅱ和 XbaI 雙切 pUC118，這兩個(gè)酶在 pUC118 上都只有一個(gè)酶切位點(diǎn)， 而在 λDNA 上的酶切位點(diǎn)分別是 35 個(gè)和 1 個(gè)。根據(jù)酶活性的定義，相同單位的 Hinc Ⅱ和 XbaI 對(duì) pUC118 的酶切效率是 35 比 1，所以在雙酶切體系中，所用的 Hinc Ⅱ顯然應(yīng)該要少很多。舉這個(gè)例子，是想說明：大家再考慮酶濃度的時(shí)候，應(yīng)該多想一層。

綜上所述，酶切切過頭了的原因，其實(shí)并沒有酶切切不動(dòng)那么復(fù)雜。不外乎時(shí)間過長和酶量太大。童鞋們只要注意一些，一般都沒有問題。