染色質(zhì)免疫共沉淀值得注意的15個(gè)細(xì)節(jié)

染色質(zhì)免疫共沉淀，又叫 Chip（Chromatin Immunoprecipitation）。Chip 又正好是英語(yǔ)里面薯片的意思。為了有趣，就叫薯片實(shí)驗(yàn)吧。做薯片做了幾個(gè)月，時(shí)間不長(zhǎng)，但深刻體會(huì)到了魔鬼都在細(xì)節(jié)中和細(xì)節(jié)決定成敗?，F(xiàn)在把值得注意的 15 個(gè)細(xì)節(jié)總結(jié)如下：

1、cell counting：盡量做到準(zhǔn)確準(zhǔn)確再準(zhǔn)確，否則會(huì)影響 input 結(jié)果。 

2、cross link：甲醛的終濃度是 1%，這個(gè)基本所有的 protocol 上都會(huì)強(qiáng)調(diào)。 

3、resuspend cells with SDS:一定要選用小的 tip 頭，在液面下吹打，否則很容易產(chǎn)生氣泡，后面的 sonication 就麻煩了。 

4、sonication：Chip 實(shí)驗(yàn)中最重要的一部分，合適的條件要自己摸索，可以一次嘗試不同次數(shù)的 sonication，然后建議采用 EZ-ChIP 上推薦的方法看看 sonication 的效果如何。

5、加入 salmon sperm DNA/Protein A or G 之前要先混勻，因?yàn)?salmon sperm DNA 是很粘稠的物質(zhì)，若不混勻，后面你會(huì)發(fā)現(xiàn) beads 的量不一樣，自然也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。 

6、wash 的時(shí)候前面幾個(gè)步驟可以不用洗的太干凈，但最后一個(gè)要盡量吸干凈，必要時(shí)可用 gel loading tips 吸。 

7、含 beads 的 samples 離心時(shí)，有的 protocol 上推薦是 1000rpm，45 秒，但可以根據(jù)情況調(diào)整，但要注意轉(zhuǎn)速不能太快防止 beads 破碎。（當(dāng)然如果采用的是 magnetic 的 beads 就不存在這個(gè)問(wèn)題）

8、reverse crosslink 可以是 65°C 4 個(gè)小時(shí)，也可以 overnight。 

9、reverse crosslink 后的在進(jìn)行下面步驟之前建議先離心，把蒸發(fā)到離心管蓋子上的部分離下來(lái)。 

10、每次行 real time PCR 之前都要把 sample 離心保證取樣的準(zhǔn)確。 

11、1~10ul 的槍取 3ul 以上才比較準(zhǔn)確，所以考慮好自己 PCR 反應(yīng)體系的配置。

12、一個(gè) Chip 實(shí)驗(yàn)一般需要 3~4 天的時(shí)間。但是，其中有幾個(gè)步驟是可以中途停下來(lái)的。畢竟，誰(shuí)也沒(méi)有辦法不眠不休地連續(xù) 3、4 天一口氣做完。下面是幾個(gè)可以停下來(lái)喘口氣的地方： 

（1）細(xì)胞收集：用含蛋白酶抑制劑的 PBS 洗滌離心，去上清的細(xì)胞收集液可置-80°C 凍存； 

（2）用 SDS 重懸細(xì)胞后可置-80°C 凍存； 

（3）sonication 結(jié)束，離心后的上清置新的離心管后可-80°C 凍存； 

（4）reverse cross-link 后的標(biāo)本可-80°C 凍存。凍存后就可以該干啥干啥去了。想接著做的時(shí)候，拿出來(lái)解凍就可以啦。 

13、agarose beads 的 wash 過(guò)程中以及后面的 DNA 提取過(guò)程中乙醇的 wash，可以用細(xì)胞室的那種吸引器，接上 200ul 的 tip 頭吸，這樣會(huì)節(jié)省很多時(shí)間（每個(gè)實(shí)驗(yàn)室情況可能不一樣）。

14、DNA 提取后建議用水溶解 DNA，因?yàn)?TE buffer 里的 EDTA 可能會(huì)影響 PCR 反應(yīng)體系中的 Mg2+。

15、溶解 DNA 的水量可以根據(jù) PCR 反應(yīng)體系的要求適當(dāng)調(diào)整。

綜上所述，我們探討了做 Chip 實(shí)驗(yàn)需要注意的 15 個(gè)小細(xì)節(jié)。細(xì)節(jié)雖小，但是卻很重要。需知魔鬼都是在細(xì)節(jié)中！