如何在WB中順利獲取大分子蛋白？

分子量大于 150Ka 的蛋白，經(jīng)常折磨我們實(shí)驗(yàn)人。想當(dāng)初，辛辛苦苦忙到深夜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯影空空如也。連續(xù)幾個(gè)月如此，內(nèi)心是何等抓狂。當(dāng)大分子條帶第一次出來的時(shí)候，心里特別開心，就像見到了初戀情人一樣?？吹街車型适芾в诖蠓肿拥鞍?，想一想當(dāng)初所面對(duì)的困境。 

在此,分享一下大分子蛋白的心得，希望這些經(jīng)驗(yàn)對(duì)那些與大分子蛋白奮戰(zhàn)的童鞋提供幫助。 

提蛋白時(shí)應(yīng)加入 RIPA 強(qiáng)效裂解液，在 4℃環(huán)境下靜置的時(shí)間延長(zhǎng)十分鐘到二十分鐘。這樣可以充分裂解大分子蛋白（裂解不充分，大分子蛋白的電泳速度會(huì)很慢）。電泳時(shí)，電泳的時(shí)間要足夠長(zhǎng)。

電泳全程采用 120-150V 的高電壓，使 Marker 拉開足夠大的距離。電泳時(shí)要在冰水浴中進(jìn)行。 

轉(zhuǎn)膜時(shí)，濕轉(zhuǎn)法與半干轉(zhuǎn)法均可以（濕轉(zhuǎn)法獲得條帶漂亮。半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜效率高），轉(zhuǎn)膜時(shí)，要保留分離膠（好多分子量超過 250KDa 的蛋白就殘留在濃縮膠中！這是血的教訓(xùn)！當(dāng)初好 幾次傻傻的把濃縮膠扔了，結(jié)果神馬條帶都沒有?。?。

先說濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜緩沖液中甲醇濃度最高 10%，加入 SDS，使 SDS 終濃度達(dá)到 5%（大于 300KDa 的蛋白，轉(zhuǎn)膜液中 SDS 的終濃度可以到 10%)。以下摸索出來濕轉(zhuǎn)法的轉(zhuǎn)膜時(shí)間（曾經(jīng)試驗(yàn)過 30mA 小電流轉(zhuǎn)膜過夜的方法，PVDF 膜上神馬都沒有。建議大家不要嘗試?。?。

用半干轉(zhuǎn)時(shí)轉(zhuǎn)膜效率高。恒壓模式設(shè)置為 40V 電壓，轉(zhuǎn)膜 60-90min。一般小于 400KDa 的蛋白都能轉(zhuǎn)到 PVDF 膜上。 

或者用恒流法轉(zhuǎn)，電流大小設(shè)置為 PVDF 膜的面積，轉(zhuǎn)一個(gè)小時(shí)左右就可以出來。若怕轉(zhuǎn)膜過頭，可以將兩張 PVDF 膜重疊起來（總會(huì)有一張膜上有條帶）。 

因?yàn)槎鄶?shù)大分子蛋白是膜蛋白，表達(dá)較少，建議延長(zhǎng)一抗孵育時(shí)間。有一次甚至孵育了四天才出結(jié)果。大分子蛋白與 PVDF 膜的結(jié)合不是很牢固，容易脫落，因此在洗膜時(shí)要操作輕柔，不要過于粗暴，否則抗原抗體復(fù)合物容易脫落。 

這些經(jīng)驗(yàn)是從幾百次失敗的實(shí)驗(yàn)中總結(jié)出來的，希望對(duì)大家有所幫助。實(shí)驗(yàn)失敗不可怕， 重要的是要勇于面對(duì)，仔細(xì)思考，敢于改進(jìn)。

最后，祝大家實(shí)驗(yàn)順利，早出漂亮結(jié)果！