分享哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的9個(gè)基本技巧！

一、凈化空氣

在開(kāi)始任何組織培養(yǎng)工作之前，打開(kāi)新風(fēng)系統(tǒng)至少15分鐘，確保有清潔的空氣流入。要始終確保沒(méi)有任何東西覆蓋它。每周打開(kāi)紫外線(xiàn)燈3-4次，最多半個(gè)小時(shí)，可以幫助保持你的實(shí)驗(yàn)室無(wú)污染，但你應(yīng)該記住，紫外線(xiàn)只會(huì)殺死它直接照射到的微生物。紫外線(xiàn)照射對(duì)眼睛和皮膚也是有害的，所以在使用遮光罩時(shí)，請(qǐng)保持光線(xiàn)關(guān)閉。在工作前后用消毒劑擦拭超凈臺(tái)（大多數(shù)人使用70%的乙醇，但你也可以使用Incidin濕巾）。

二、遠(yuǎn)離污染物

雖然你很可能是實(shí)驗(yàn)的主要污染源，但是你*有必須要采取你所及的的預(yù)防措施，防止細(xì)胞受到污染。用70%乙醇擦拭實(shí)驗(yàn)室的所有東西，包括你戴手套的手！你還應(yīng)該在開(kāi)始之前把所有的珠寶和你戴的手表都取下來(lái)。此外，避免不必要的交談，因?yàn)榻徽剷?huì)產(chǎn)生微生物氣溶膠，可能會(huì)進(jìn)入超凈臺(tái)。在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前*計(jì)劃你的實(shí)驗(yàn)是另一個(gè)防止污染的好方法。這聽(tīng)起來(lái)很瑣碎，但往往能在問(wèn)題出現(xiàn)之前解決大多數(shù)問(wèn)題。有了適當(dāng)?shù)挠?jì)劃，你就可以確切地知道你需要把什么材料帶進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，并且可以帶入之前把它們都擦干凈。

三、分裝試劑，保持實(shí)驗(yàn)室整潔

儲(chǔ)物柜最好不要帶護(hù)罩。雜亂無(wú)章不僅使你的工作區(qū)很難清潔干凈，而且還會(huì)破壞工作區(qū)周?chē)膶恿鳉饬?。確保只將所需材料帶入工作區(qū)域。這將給你足夠的空間自由移動(dòng)而不會(huì)造成泄漏。另外，當(dāng)液體容器不能立即使用時(shí)，請(qǐng)將其蓋緊。防止泄漏，但如果發(fā)生任何泄漏，應(yīng)立即用70%乙醇擦拭。最后，避免將移液管直接插入培養(yǎng)基瓶中，而應(yīng)先將溶液倒入一次性無(wú)菌管中，分裝使用不但能方便管理更能避免出現(xiàn)大規(guī)模的污染。

四、確保細(xì)胞不要離開(kāi)培養(yǎng)箱太久

當(dāng)你準(zhǔn)備東西的時(shí)候，確保你的細(xì)胞不會(huì)在外面呆太久。培養(yǎng)箱的舒適區(qū)通常在37度左右°5%的二氧化碳，溫度突然變化（尤其是開(kāi)空調(diào)的時(shí)候）會(huì)讓細(xì)胞變得焦躁不安，所以把它們放在無(wú)菌培養(yǎng)箱中。這也意味著任何與細(xì)胞接觸的培養(yǎng)基或洗滌緩沖液，如PBS（磷酸鹽緩沖鹽水），都應(yīng)該在37°C.這也是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都有一個(gè)37度的水浴目的。

五、注意細(xì)胞的形狀和大小

你應(yīng)該在超凈臺(tái)附近放一個(gè)光學(xué)顯微鏡，這樣你可以定期觀察你的細(xì)胞（在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室之前和將它們放入培養(yǎng)箱時(shí)）。這也有助于熟悉你正在使用的細(xì)胞系的形態(tài)，以便識(shí)別交叉污染。即使某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞系具有相似的形態(tài)，但是觀察細(xì)胞是否污染，顯微鏡一定不可少。

六、合理的設(shè)置細(xì)胞傳代

不要偷懶于分割細(xì)胞，而要形成一個(gè)常規(guī)。對(duì)于大多數(shù)快速生長(zhǎng)的細(xì)胞系（如HEK293，每16小時(shí)增殖一次），一周兩次通常有效。例如，如果你在星期一將細(xì)胞稀釋1:5進(jìn)行傳代，你應(yīng)該可以在下一個(gè)星期四，或者最遲在星期五進(jìn)行分裂。最好在細(xì)胞板80-85%匯合之前分裂細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞這個(gè)時(shí)候?qū)儆谏L(zhǎng)鼎盛期。如果它們達(dá)到匯合點(diǎn)，就會(huì)進(jìn)入平頂期，它們就會(huì)停止生長(zhǎng)（接觸抑制），經(jīng)過(guò)傳代后需要時(shí)間才能恢復(fù)。這可能會(huì)改變它們的生長(zhǎng)速率和形態(tài)，使得它們不適宜繼續(xù)用于需要可復(fù)制結(jié)果的實(shí)驗(yàn)。大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基含有pH指示劑酚紅（pH范圍6.0（黃色）-8.0（紅色））。血液pH值通常在7.35-7.4左右，因此哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)pH值很敏感。橙色和淺橙色之間的顏色通常都表明細(xì)胞需要換液或者已經(jīng)足夠生長(zhǎng)，通過(guò)分泌乳酸（細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞有毒）使周?chē)慕橘|(zhì)變酸，這個(gè)時(shí)候若細(xì)胞密度太大就選擇傳代。

七、細(xì)胞狀態(tài)就是力量！

當(dāng)用一個(gè)新的細(xì)胞系開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞生長(zhǎng)，將其等分成若干小瓶，冷凍，除一個(gè)外，其余全部?jī)?chǔ)存在液氮中。冷凍的小瓶組成了你的主庫(kù)存，而你可以用剩下的小瓶來(lái)生長(zhǎng)和冷凍額外的細(xì)胞，這些細(xì)胞可以作為你的工作庫(kù)存。這可以確保您有許多細(xì)胞儲(chǔ)存在其原始狀態(tài)，一旦工作細(xì)胞變得太老化或污染。您還有之前的庫(kù)存細(xì)胞可以取代。這也確保了任何在實(shí)驗(yàn)室需要新細(xì)胞的人都可以帶上一瓶“原始狀態(tài)"的主庫(kù)存，而不是“借用"已經(jīng)經(jīng)過(guò)多次傳代并可能被污染的細(xì)胞。

八、注意實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞代次

注意傳代次數(shù)。細(xì)胞在高傳代數(shù)（>30-40倍）時(shí)會(huì)改變它們的生長(zhǎng)速度和形態(tài)，這取決于細(xì)胞系，所以舊細(xì)胞應(yīng)該退役！相反，第3-4代年輕的細(xì)胞太年輕，不應(yīng)該在立即用于重要的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。額外的傳代可以讓你的細(xì)胞獲得穩(wěn)定的生長(zhǎng)速度。

在你的盤(pán)子和/或燒瓶上貼上你的名字、日期、你使用的細(xì)胞系和它的通道號(hào)是一種很好的做法。特別是在一個(gè)多人從事不同工作的實(shí)驗(yàn)室里，這將有助于你避免意外混合造成交叉污染，也有助于你保持良好的實(shí)驗(yàn)記錄。

九、及時(shí)滅菌是細(xì)胞的狂歡！

最后，但并非最不重要的一點(diǎn)是，任何用于再利用的實(shí)驗(yàn)室材料（例如，用于液體廢物的巴斯德移液管）在每次使用前都應(yīng)消毒。此外，所有受污染的液體和固體廢物在處理前應(yīng)進(jìn)行高壓滅菌。