3D細(xì)胞培養(yǎng)的操作步驟

體外三維細(xì)胞建模和成像是候選分子毒性評(píng)估的一個(gè)有價(jià)值的早期步驟，3D細(xì)胞培養(yǎng)很大程度上可檢測(cè)臨床前藥物開(kāi)發(fā)工作流程，包括在細(xì)胞、組織、器官和整個(gè)有機(jī)體的迭代更高生物水平上的毒性評(píng)估。在這些層次上建模和成像的能力是分子評(píng)估和發(fā)展的強(qiáng)大工具。

3D細(xì)胞培養(yǎng)中的單個(gè)細(xì)胞提供了關(guān)于分子亞細(xì)胞對(duì)一般細(xì)胞功能的影響的數(shù)據(jù)，如細(xì)胞生長(zhǎng)速度。3D細(xì)胞培養(yǎng)也用于評(píng)估特定細(xì)胞類(lèi)型的毒性，提供組織和器官功能的數(shù)據(jù)。

3D細(xì)胞培養(yǎng)允許細(xì)胞生長(zhǎng)，培養(yǎng)物向各個(gè)方向擴(kuò)展，從而模擬自然的微結(jié)構(gòu)。這種類(lèi)型的培養(yǎng)提供了對(duì)分子對(duì)細(xì)胞間相互作用的影響，其方式比二維單層培養(yǎng)更具生理學(xué)意義。3D培養(yǎng)的高分辨率成像提供了分子對(duì)組織結(jié)構(gòu)和完整性的影響的有價(jià)值的信息。

在藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程的早期，擁有相關(guān)的、可靠的和可預(yù)測(cè)的細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)，可以避免可能導(dǎo)致臨床試驗(yàn)失敗的毒性試驗(yàn)，從而有助于降低用藥風(fēng)險(xiǎn)和科研成本。

一． 實(shí)驗(yàn)試劑準(zhǔn)備：

1.準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)試劑

2.將分裝好的Matrigel基質(zhì)膠提前24 h從-20℃放入4℃，使其融化成液體狀態(tài)；將無(wú)菌的1 mL移液器槍頭放入無(wú)菌50 mL離心管內(nèi)，置-20℃冰箱預(yù)冷。

瓊脂糖包被96孔板

3.準(zhǔn)確量取6 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基于2個(gè)10 mL的注射玻璃瓶?jī)?nèi)，加入90 mg瓊脂糖，蓋塞后放入80℃的水浴鍋內(nèi)加熱溶解30 min；

4.加熱結(jié)束后，將注射瓶放入滅菌鍋內(nèi)，115℃滅菌30 min；

滅菌完成后，迅速取出注射瓶放入超凈臺(tái)內(nèi)。將注射瓶?jī)?nèi)的瓊脂糖溶液倒入無(wú)菌的加樣槽中，用多通道移液器以每孔60 μL的量加入96孔板內(nèi)。

注意：由于瓊脂糖溶液在室溫時(shí)會(huì)凝固，因此從滅菌鍋內(nèi)取出瓊脂糖溶液后一定要快速轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)內(nèi)并迅速加入至96孔板中。

此外，為保證加樣時(shí)瓊脂糖不冷卻，需要同時(shí)滅菌加樣槽和100 μL的移液器槍頭。

5. 加入完成后，96孔板要保持水平約30 min使孔內(nèi)的瓊脂糖凝固。

配置含Matrigel基質(zhì)膠細(xì)胞懸液

二.3D細(xì)胞培養(yǎng)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以cell systems原代視網(wǎng)膜內(nèi)皮為例，胰蛋白酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用CultureBoost經(jīng)典細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至2.0×105 cells/mL，備用。

將盛滿碎冰的燒杯噴完酒精后放入超凈臺(tái)內(nèi)，將CultureBoost經(jīng)典細(xì)胞培養(yǎng)基以及解凍的Matrigel基質(zhì)膠從冰箱內(nèi)取出置于冰上.

注意：由于Matrigel基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固，因此在操作過(guò)程中一定要保持低溫。

3. 將預(yù)冷的移液器槍頭取出放置于超凈臺(tái)內(nèi)。根據(jù)計(jì)算量（2.5%，v/v）用移液器將300 μL Matrigel基質(zhì)膠加入到12 mL *培養(yǎng)基內(nèi)，迅速混勻。

注意：由于Matrigel基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固，因此使用的移液器槍頭也需要預(yù)冷。

加入步驟1中的細(xì)胞懸液（約600 μL），使細(xì)胞濃度為10000 cells/mL，迅速混勻，備用；

將細(xì)胞懸液鋪入瓊脂糖包被的96孔板

1. 將上述步驟4中配置好的含有Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞懸液放入加樣槽內(nèi)，用多通道移液器吸取200 μL加入到包被瓊脂糖的96孔板內(nèi)。

2. 采用低溫離心機(jī)進(jìn)行離心，離心條件為4℃，1000×g，10 min,將96孔板周?chē)梅饪谀し庾　?/p>

3.人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)的比較慢在培養(yǎng)的第3.7和10天，并2天更換一次孔內(nèi)的100ul培養(yǎng)基。

若要做給藥實(shí)驗(yàn)，計(jì)算好OD值和IC50，配成100ul的培養(yǎng)基，培養(yǎng)成球后，吸出常規(guī)培養(yǎng)基換成加藥培養(yǎng)基即可。

Cell systems 3D培養(yǎng)參考文獻(xiàn)：

Brown JA, Pensabene V, Markov DA, Allwardt V, Neely MD, Shi M, Britt CM, Hoilett OS, Yang Q, Brewer BM, Samson PC, McCawley LJ, May JM, Webb DJ, Li D, Bowman AB, Reiserer RS, Wikswo JP. Biomicrofluidics. 2015 Sep; 9(5): 054124. doi: 10.1063/1.4934713

Herland A, van der Meer AD, FitzGerald EA, Park T-E, Sleeboom JJF, Ingber DE. PLoS ONE. 2016; 11(3): e0150360. doi: 10.1371/journal.pone.0150360