實(shí)驗(yàn)分享：血腦屏障實(shí)驗(yàn)的操作步驟

從19世紀(jì)末，保羅·埃爾利希在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了這個(gè)屏障，后期科學(xué)家跟進(jìn)研究后發(fā)現(xiàn)血腦屏障（BBB）對(duì)機(jī)體發(fā)揮著重要作用。BBB結(jié)構(gòu)和功能的完整對(duì)于維持神經(jīng)元功能，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受病原體、炎性因子、損傷的影響有重要意義。缺血性腦血管病的發(fā)生、發(fā)展與BBB結(jié)構(gòu)和功能的破壞密切相關(guān)。

一． 實(shí)驗(yàn)試劑準(zhǔn)備：

1. 準(zhǔn)備好無(wú)鈣鎂離子PBS磷酸鹽緩沖液，cell systems人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（貨號(hào)：ACBRI 376)建議使用無(wú)鈣鎂離子的緩沖液實(shí)驗(yàn).

2. 通過(guò)稀釋 0.5 mg/mL 纖維素溶液和 0.3 mg/mL 膠原蛋白 IV 溶液，在 1.5 mL 微管中分別使用 1x PBS 至 100 mg/μL 等分，制備 10 μg/mL 膠原蛋白 IV 和 10 μg/mL 纖維素溶液。此后，將兩種等分的100μL與1，800μL的1x PBS混合在2 mL微管中，并將其儲(chǔ)存在-20°C。也可使用cell systems原代細(xì)胞專(zhuān)用包被液（貨號(hào)：4Z0-201），鋪板后靜等2分鐘，吸掉包被基質(zhì)，直接鋪板細(xì)胞，節(jié)約時(shí)間，簡(jiǎn)單方便。

3. 預(yù)備好培養(yǎng)基，cell systems原代細(xì)胞經(jīng)典培養(yǎng)基(貨號(hào)：4Z0-500)包含包被液和生長(zhǎng)因子，并且不含抗生素。

4. 準(zhǔn)備胰酶，在 50 mL 管中稀釋 45 mL 的 1x PBS 的 10x 濃縮胰蛋白酶-EDTA 溶液的 5 mL，制備 1x 胰蛋白酶-EDTA 溶液并將其儲(chǔ)存在 4°C，也可以cell systems傳代套裝（貨號(hào)：4Z0-800),包含PBS，胰酶，胰酶中和液，一套解決所有消化試劑的準(zhǔn)備問(wèn)題。

5. 在 500 mL 玻璃瓶中稱(chēng)量 10 g LB 肉湯，制備 500 mL LB 介質(zhì)。加入500 mL的消毒水，并高壓滅菌。

6. 在 500 mL 玻璃瓶中稱(chēng)量 10 g LB 肉湯和 7.5 g 的瓊脂，準(zhǔn)備 LB 瓊脂。在高壓滅菌前加入500 mL的消毒水，不要關(guān)閉燒瓶蓋。高壓滅菌器，讓溶液冷卻，直到可以接觸。

二.血腦屏障細(xì)胞的生長(zhǎng)

1. 使用12 孔板，請(qǐng)將細(xì)胞包被液種到孔里。

2. 將板和每個(gè)刀片解壓在生物安全柜中，并在那里執(zhí)行進(jìn)一步步驟。使用消毒鉗抓住刀片在其寬基上移動(dòng)它。

3. 用90μL的10微克/mL膠原蛋白IV和10μg/mL纖維蛋白混合物覆蓋每個(gè)刀片的多孔膜。之后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，在37°C下孵化。

4. 將 1 mL 的 1x PBS 移入每個(gè)刀片，然后用真空泵吸出溶液，用于細(xì)胞培養(yǎng)，將刀片洗滌兩次。

 注意：若使用cell systems細(xì)胞包被液，前三的步驟可省略為：使用移液管將包被液移入孔板里，靜等2分鐘后吸出，無(wú)需清洗，直接執(zhí)行第四步。

5. 通過(guò)在上部移液 0.5 mL 的預(yù)熱 cell systems經(jīng)典細(xì)胞培養(yǎng)基和下腔室的 1.5 mL 來(lái)平衡膜。在具有5%CO2大氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在37°C下孵育30分鐘

6. 種子2 x 105人類(lèi)微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入每個(gè)上腔，并在細(xì)胞培養(yǎng)箱中以37°C孵育12孔板。

7. 使用真空泵從細(xì)胞培養(yǎng)液中吸出培養(yǎng)基，然后通過(guò)移液 10 mL 的 1x PBS 清洗單層，然后用真空泵對(duì)溶液進(jìn)行吸氣。

8. 將5ml的培養(yǎng)基吸出培養(yǎng)瓶，用1x濃縮胰蛋白酶-EDTA*覆蓋細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C下孵育燒瓶3-5分鐘。注：如果細(xì)胞未分離，請(qǐng)輕拍培養(yǎng)瓶讓細(xì)胞脫落。

9. 加含有血清的培養(yǎng)基中和

10. .在 210 x g下將懸浮液離心 3 分鐘，用真空泵去除上清液，用移液器將細(xì)胞重新懸浮在 5 mL 的培養(yǎng)基。

11.  將細(xì)胞懸浮液的10μL與10μL的0.4%臺(tái)盼染色劑混合在1.5 mL微管中，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器。將10μL的混合物加入計(jì)數(shù)室滑塊，放入細(xì)胞計(jì)數(shù)器，然后開(kāi)始計(jì)數(shù)。

12. .將計(jì)數(shù)器聚焦在單元格上，使其邊緣為深藍(lán)色和中間白色。之后，啟動(dòng)適當(dāng)?shù)募?xì)胞計(jì)數(shù)程序。

13.要計(jì)算每個(gè)刀片的體積，請(qǐng)將每刀片獲得的 2 x 10^5個(gè)單元格的細(xì)胞懸浮液的計(jì)算濃度分開(kāi)。

三. 血腦屏障模型的培養(yǎng)

在37°C下孵育12孔板14天。

上腔室的培養(yǎng)基每天更換 0.5 mL，下腔培養(yǎng)基每 2-3 天更換 1.5 mL。在更換培養(yǎng)基之前，請(qǐng)先預(yù)熱。真空泵吸氣，避免產(chǎn)生氣泡注意：小心工作，避免接觸膜。

通過(guò)顯微鏡成像細(xì)胞，檢查細(xì)胞的狀態(tài)，并確定匯合。確保14天后匯合度為100%。

四. 細(xì)菌的制備

1. 測(cè)量前一天，將大腸桿菌菌株的菌群復(fù)蘇在LB培養(yǎng)基里。在37°C下孵育培養(yǎng)24小時(shí)，在孵育搖床中孵育180rpM

2. 在 4°C 的 LB 瓊脂板上培養(yǎng)大腸桿菌菌株。取一個(gè)帶消毒的采摘管，并將采摘放入具有 3 mL LB 瓊脂培養(yǎng)基制備的培養(yǎng)管中。

3. 為每個(gè)刀片準(zhǔn)備一個(gè) LB 瓊脂板，并填充培養(yǎng)皿，將其總體積減半。讓他們變成固體，并存儲(chǔ)在4°C。

五.  細(xì)胞的藥物實(shí)驗(yàn)

1. 播種后的第14天，用化合物處理細(xì)胞或測(cè)量轉(zhuǎn)皮電阻（TEER），。

2. 要是由感興趣的化合物處理細(xì)胞，將該化合物稀釋到調(diào)整好濃度稀釋到*培養(yǎng)基中。將0.5 mL的混合物加入上腔室，將1.5 mL添加到下腔。再次進(jìn)行培養(yǎng)。之后，通過(guò)真空泵吸氣和移液進(jìn)行正常的細(xì)胞換液處理。

六. 滲透性測(cè)量

1. 為了獲得恒定的細(xì)菌濃度，用波長(zhǎng)為600納米的光度計(jì)測(cè)量光密度。用LB培養(yǎng)基在50 mL falcon管中將過(guò)夜的細(xì)菌溶液稀釋至OD600為0.5±0.05。在冰上工作。

2. 向比色皿中加入1毫升LB培養(yǎng)基。啟動(dòng)光度計(jì)，將比色杯放入，標(biāo)記側(cè)朝前。按下底部“空白"，然后測(cè)量空白值。

3. 將細(xì)菌溶液注入比色杯中，放入比色杯中，然后按壓底部樣品，測(cè)量細(xì)菌溶液的密度。在稀釋過(guò)程中重復(fù)測(cè)量，直到獲得最終濃度。

4. 在生物安全柜中工作，可使用準(zhǔn)備好的12孔板和OD600=0.5的細(xì)菌溶液處理細(xì)菌。僅向每個(gè)含有0.5 mL培養(yǎng)基的上腔中添加450µL細(xì)菌溶液。

5. 在37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12孔板6小時(shí)。

6. 用移液管從每個(gè)下腔取50µL培養(yǎng)基樣品，方法是用鑷子取下插入物。注意不要將培養(yǎng)基從上腔濺到下腔。

7. 將每個(gè)樣品置于單獨(dú)的瓊脂平板上。將樣品滴在平板上，用細(xì)胞撒布器劃出溶液。

8. 在37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)瓊脂平板24小時(shí)。

9.計(jì)算每個(gè)平板中的菌落數(shù)

CELL SYSTEMS血腦屏障部分參考文獻(xiàn)：

1."Cysteinyl leukotriene receptor type 1 antagonist montelukast protects against injury of blood–brain barrier" Zhou et al. Inflammopharmacology, 2019

2."Alterations of the Endocannabinoid System in Post-ischemic Endothelial Cells of the Blood Brain Barrier" Thurston (Dissertation) 2019

3.Exosome-Mediated Transfer of ACE2 (Angiotensin-Converting Enzyme ） from Endothelial Progenitor Cells Promotes Survival and Function of Endothelial Cell" Wang et al. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2020

4."RAGE and CCR7 mediate the transmigration of Zika-infected monocytes through the blood-brain barrier" Costa de Carvalho et al. Immunobiology, 2019

5."Binding Heterogeneity of Plasmodium falciparum to Engineered 3D Brain Microvessels Is Mediated by EPCR and ICAM-1" Bernabeu et al. mBio, 2019

6."In Vitro Cell Models of the Human Blood-Brain Barrier: Demonstrating the Beneficial Influence of Shear Stress on Brain Microvascular Endothelial Cell Phenotype" Rochfort and Cummins et al. Blood-Brain Barrier, 2018

7."Modulation of glucocorticoid receptor in human epileptic endothelial cells impacts drug biotransformation in an in vitro blood–brain barrier model" Ghosh et al. Epilepsia, 2018.