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    細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)技術(shù)——功能實(shí)驗(yàn)的第一步

    發(fā)布時(shí)間： 2021-10-21　　點(diǎn)擊次數(shù)： 2185次

    轉(zhuǎn)染(transfection)是真核細(xì)胞主動(dòng)或被動(dòng)導(dǎo)入外源核酸片段（DNA或RNA）而獲得新的表型的過(guò)程。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生重組蛋白，或者特異性的增強(qiáng)/抑制細(xì)胞中的基因表達(dá)。轉(zhuǎn)染后的檢測(cè)主要包括基因水平和蛋白水平的檢測(cè)。一定時(shí)間后收集轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞，采用超聲或酶解的方法破碎細(xì)胞，離心得到上清。針對(duì)基因水平，使用普通 PCR 或 RT-PCR 進(jìn)行驗(yàn)證，蛋白水平，使用 western blot 檢測(cè)，簡(jiǎn)單，快速，準(zhǔn)確。

    細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)技術(shù)——功能實(shí)驗(yàn)的第一步

    轉(zhuǎn)染的類(lèi)型

    根據(jù)導(dǎo)入的核酸存在于宿主細(xì)胞的時(shí)間長(zhǎng)短，可以分為瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)。根據(jù)轉(zhuǎn)染方式可以分為化學(xué)方法，生物方法，物理方法。

    瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是指將構(gòu)建好的質(zhì)?；蛘遱iRNA通過(guò)某種方式導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)（常用的工具細(xì)胞 HEK293 細(xì)胞），該外源核酸片段不整合到細(xì)胞自身的基因組上。隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂，外源基因會(huì)逐漸丟失，在細(xì)胞內(nèi)能夠存在 3-4 天，無(wú)法隨著細(xì)胞的分裂進(jìn)入到子代細(xì)胞中。在這一段時(shí)間內(nèi)，外源基因在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)錄翻譯，得到少量的蛋白。根據(jù)使用的載體不同，收集目的基因/蛋白進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)間不同，通常在轉(zhuǎn)染后48h，目的蛋白的表達(dá)水平最高。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)是短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行蛋白的小量制備，滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求。

    穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是外源DNA整合到細(xì)胞基因組中，成為細(xì)胞基因組的一部分從而得以復(fù)制，隨著細(xì)胞分裂，子代細(xì)胞也同樣表達(dá)外源基因，這就是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的標(biāo)志。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是建立在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上的，先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，再對(duì)得到的細(xì)胞池進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)記是抗生素，熒光報(bào)告基團(tuán)等，通常需要2-3周的篩選時(shí)間，由此形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)是能夠得到蛋白的大量、長(zhǎng)期生產(chǎn)，滿足后續(xù)的一系列體內(nèi)體外的表型實(shí)驗(yàn)。

    轉(zhuǎn)染方式

    考慮到轉(zhuǎn)染效率是影響細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的重要因素，因此選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染方式很關(guān)鍵。下面我們介紹一下常見(jiàn)的轉(zhuǎn)染方式。

    細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)技術(shù)——功能實(shí)驗(yàn)的第一步

    細(xì)胞由帶負(fù)電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成，對(duì)于也帶負(fù)電荷的核酸片段（DNA和RNA）來(lái)說(shuō)是不可透過(guò)的屏障，因此研究人員開(kāi)發(fā)了很多方法能使核酸穿透細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，大致分為三類(lèi)：

    轉(zhuǎn)染方法

    原理

    優(yōu)點(diǎn)

    缺點(diǎn)

    化學(xué)轉(zhuǎn)染方法

    陽(yáng)離子脂質(zhì)體

    脂質(zhì)體是一種人工的脂雙層膜。陽(yáng)離子脂質(zhì)體通常由陽(yáng)離子和兩性離子脂質(zhì)組成。在DNA與脂質(zhì)體形成lipoplex的過(guò)程中，陽(yáng)離子脂質(zhì)體起到復(fù)合和凝集DNA的作用，同時(shí)也有助于復(fù)合物與細(xì)胞膜的結(jié)合

    操作簡(jiǎn)單快速；

    轉(zhuǎn)染效率高且重復(fù)性好；

    可用于轉(zhuǎn)染DNA、RNA和蛋白；

    可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

    會(huì)受到血清的抑制，降低轉(zhuǎn)染效率；

    脂質(zhì)體中的核心組分對(duì)細(xì)胞毒性較大

    磷酸鈣共沉淀

    核酸以磷酸鈣-DNA 共沉淀物的形式出現(xiàn)時(shí)，可使DNA 附在細(xì)胞表面，利于細(xì)胞吞入攝取，或通過(guò)細(xì)胞膜脂相收縮時(shí)裂開(kāi)的空隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)

    便宜，使用廣泛

    轉(zhuǎn)染效率差，不穩(wěn)定；

    細(xì)胞毒性大；

    葡聚糖

    它是一種陽(yáng)離子聚合物，可以與帶負(fù)電荷的DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合，進(jìn)而被細(xì)胞吞噬

    多用于貼壁細(xì)胞

    一些細(xì)胞類(lèi)型對(duì)葡聚糖特別敏感，可能會(huì)發(fā)生形態(tài)變化或者抑制細(xì)胞生長(zhǎng)

    其他陽(yáng)離子聚合物

    帶正電的聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，并通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。陽(yáng)離子聚合物和陽(yáng)離子脂質(zhì)體最大的區(qū)別在于陽(yáng)離子聚合物不含疏水部分而*溶于水，可以方便地進(jìn)行化學(xué)修飾，且不會(huì)像脂質(zhì)體一樣破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，所以相對(duì)毒性較低。目前使用*泛的陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑是PEI（聚乙烯亞胺）

    成本低；

    免疫原性低；

    轉(zhuǎn)染效率高且穩(wěn)定；

    適用于懸浮細(xì)胞或貼壁細(xì)胞

     

     

    細(xì)胞毒性較大；

    常用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染；

    不能生物降解

    物理轉(zhuǎn)染方法

    電穿孔

    利用高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，使得DNA 通過(guò)膜上形成的小孔導(dǎo)入穩(wěn)定/瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染

    適用所有細(xì)胞類(lèi)型；

    適用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；

    不需要載體

    需要一定的電轉(zhuǎn)設(shè)備；

    需要優(yōu)化電轉(zhuǎn)脈沖和電壓參數(shù)；

    細(xì)胞致死率高；

    DNA和細(xì)胞用量大

    顯微注射

    利用管尖極細(xì)（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細(xì)胞中

    適用所有細(xì)胞類(lèi)型；

    可進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)染；

    不需要載體；

    不限制轉(zhuǎn)入的基因大小和數(shù)量；

    多用于轉(zhuǎn)基因

    設(shè)備昂貴；

    技術(shù)要求高；

    細(xì)胞致死率高

    生物轉(zhuǎn)染方法

    病毒轉(zhuǎn)染

    病毒該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)

    轉(zhuǎn)染效率高；

    適用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系；

    可用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染

    周期長(zhǎng)，程序復(fù)雜；

    費(fèi)用相對(duì)高；

    存在生物安全問(wèn)題

    細(xì)胞由帶負(fù)電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成，對(duì)于也帶負(fù)電荷的核酸片段（DNA和RNA）來(lái)說(shuō)是不可透過(guò)的屏障，因此研究人員開(kāi)發(fā)了很多方法能使核酸穿透細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，大致分為三類(lèi)：

    轉(zhuǎn)染的影響因素：

    轉(zhuǎn)染過(guò)程中許多因素會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率：如細(xì)胞類(lèi)型；細(xì)胞密度；質(zhì)粒大小、質(zhì)粒純度；血清；轉(zhuǎn)染試劑等。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，以下幾個(gè)因素進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化：

    1. 轉(zhuǎn)染前的細(xì)胞狀態(tài)和密度

    轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度以 50-80%最佳，細(xì)胞密度過(guò)高會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率（周期進(jìn)程阻滯，凋亡增加等）。同時(shí)支原體污染會(huì)嚴(yán)重降低細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，因此轉(zhuǎn)染前可用環(huán)丙沙星處理細(xì)胞以除去支原體。

    2. 轉(zhuǎn)染時(shí)的質(zhì)粒純度

    如果提取的質(zhì)粒不純，如帶少量鹽離子，蛋白、代謝物污染等都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成；而含有內(nèi)毒素的質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞存在很大的毒性作用（一般用去內(nèi)毒素的提取試劑盒）?？股匾话銓?duì)真核細(xì)胞無(wú)毒，但轉(zhuǎn)染過(guò)程中細(xì)胞通透性增加，會(huì)使抗生素進(jìn)入細(xì)胞，從而降低細(xì)胞活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。

    3. 轉(zhuǎn)染后的篩選時(shí)間

    轉(zhuǎn)染后篩選不能太早或太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷大，增殖較慢，太晚會(huì)被沒(méi)有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒(méi)，最終導(dǎo)致篩選不出陽(yáng)性克隆。一般要在轉(zhuǎn)染后48h之后開(kāi)始加抗生素篩選。

    4. DNA 與轉(zhuǎn)染試劑的比例

    許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化 DNA 與轉(zhuǎn)染試劑的比例。不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率差別很大，通常需要根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇合適濃度的外源DNA或RNA，調(diào)整外源核酸片段和轉(zhuǎn)染試劑的比例。


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