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    做好流式太難？可能方法就用錯(cuò)了，解決思路看這里!

    發(fā)布時(shí)間： 2021-11-02　　點(diǎn)擊次數(shù)： 2298次

    流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是利用流式細(xì)胞儀對(duì)單個(gè)細(xì)胞或者生物微顆粒的生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析的檢測方式。其特點(diǎn)是能夠快速、精準(zhǔn)的分析單個(gè)細(xì)胞的多種特性，適用于定性、定量分析細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的各種細(xì)胞成分，還可以研究細(xì)胞的各種功能狀態(tài)等，特別適用于大量樣品的檢測。



    現(xiàn)已被廣泛用于免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、微生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。典型的應(yīng)用實(shí)例包括血液系統(tǒng)疾病的免疫分型，腫瘤學(xué)中細(xì)胞 DNA 的倍體和周期分析，細(xì)胞生物學(xué)研究中的細(xì)胞凋亡、增殖，細(xì)胞表面或胞內(nèi)的抗原檢測等。


    其中，流式技術(shù)較為廣泛的應(yīng)用是使用流式抗體進(jìn)行細(xì)胞的分型鑒定，常見的免疫表型分析實(shí)驗(yàn)包括單細(xì)胞懸液制備、細(xì)胞表面或胞內(nèi)抗體的染色、上機(jī)檢測等基本步驟。



    兩種常見流式細(xì)胞標(biāo)記法

    直接法和間接法各有利弊


    直接法：熒光標(biāo)記的抗體直接與細(xì)胞的抗原結(jié)合，一步孵育后即可以進(jìn)行細(xì)胞的流式上機(jī)檢測。直接法因?yàn)槠浞奖憧旖荩徊娣磻?yīng)和背景少，是目前主流的流式標(biāo)記手段。


    間接法：細(xì)胞先與一抗進(jìn)行孵育，然后熒光二抗再結(jié)合到一抗上形成免疫檢測復(fù)合物，后續(xù)即可以進(jìn)行上機(jī)。當(dāng)商品化的直標(biāo)抗體無法獲得時(shí)，間接法可以作為補(bǔ)充，但間接法在多色實(shí)驗(yàn)中很難避免種屬間的交叉反應(yīng)，選擇性會(huì)大大受到影響。


    兩種流式細(xì)胞標(biāo)記法原理見圖 1。


    圖片

    圖 1 流式抗體標(biāo)記常見的兩種形式

    （左圖為直接法，右圖為間接法）


    除選擇上述兩種商品化標(biāo)記抗體外，還可使用抗體標(biāo)記試劑盒標(biāo)記抗體，獲取實(shí)驗(yàn)所需的熒光標(biāo)記抗體，但該方法對(duì)技術(shù)要求高，標(biāo)記效果往往受多種因素影響。常見的傳統(tǒng)流式細(xì)胞標(biāo)記方法，見表 1。


    表 1 常見的傳統(tǒng)流式細(xì)胞標(biāo)記方法

    因素

    直接法

    間接法

    標(biāo)記試劑盒

    耗時(shí)

    一步操作，耗時(shí)少

    多步操作，耗時(shí)長

    耗時(shí)更長，往往需 1 個(gè)小時(shí)甚至數(shù)天

    復(fù)雜性

    不復(fù)雜，流程短

    復(fù)雜，必須選擇合適的二抗，多色實(shí)驗(yàn)中很難避免種屬間的交叉反應(yīng)

    流程更復(fù)雜，需要考慮多種因素如抗體濃度、專業(yè)技術(shù)知識(shí)、反應(yīng)清洗等

    靈活性

    不靈活，商品化決定

    靈活，使用不同的二抗可拓寬可測量靶標(biāo)的范圍

    操作更靈活，可人工組合偶連

    靈敏度

    低于間接法

    反饋更靈敏，一抗上可結(jié)合多個(gè)二抗分子

    低于間接法

    背景

    低背景，減少了非特異結(jié)合

    更多背景，可能存在內(nèi)源性結(jié)合

    更多背景，操作復(fù)雜，任何環(huán)節(jié)出錯(cuò)均會(huì)影響結(jié)果



    多色流式分析

    可同時(shí)定量檢測細(xì)胞多種特性但要求高


    隨著流式細(xì)胞儀、單克隆抗體和熒光探針的不斷發(fā)展，流式分析已經(jīng)從早期的單激光單色檢測，發(fā)展到可快速同時(shí)定量檢測一種細(xì)胞的多種特性，多色多參數(shù)多激光的檢測分析。


    同時(shí)分析多個(gè)抗原或多種細(xì)胞特性的能力為越來越復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)打開了新的大門，但多色流式細(xì)胞分析需要平衡多個(gè)難題的解法，包括儀器配置、抗原表達(dá)和染料亮度，以及可用的抗體- 染料組合等，考慮的要素見圖 2。


    圖片

    圖 2 流式多色方案設(shè)計(jì)需要考慮的要素


    流式的配色需要綜合考慮以下因素：


    儀器的配置：抗體所選擇的熒光染料必須根據(jù)儀器的激光通道以及相應(yīng)的濾片配置進(jìn)行選擇。

    抗原的表達(dá)量：待測細(xì)胞類群的豐度以及熒光染料的亮度。常見的配色原則是將亮度高的染料配給低豐度的抗原或者低豐度細(xì)胞上的抗原。

    熒光標(biāo)記的抗體的可選擇性：從供應(yīng)商處選擇流式驗(yàn)證過的符合配色需求的抗體，如果無法找到合適的供應(yīng)商，則可以考慮使用熒光二抗進(jìn)行間接標(biāo)記，但這種方案可能會(huì)造成種屬間的交叉反應(yīng)以及高背景的問題。


    如果研究人員無法在一次實(shí)驗(yàn)中妥善調(diào)和上述因素，就需要退而求其次，進(jìn)行多次分析。而多次分析難免引入各不相同的實(shí)驗(yàn)條件，由此造成的數(shù)據(jù)波動(dòng)最終會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)結(jié)果不可靠。



    默克創(chuàng)新型多色流式分析解決方案

    簡化多色流式分析流程


    ColorWheel® 流式抗體和染料組合采用專為流式細(xì)胞術(shù)優(yōu)化的專（禾刂）技術(shù)，支持用戶分別選擇抗體和染料并根據(jù)自身需要任意組合，在保證實(shí)驗(yàn)成功率的同時(shí)又可幫助簡化流式細(xì)胞分析流程，突破傳統(tǒng)流式分析方案的局限。


    主要優(yōu)勢：


    突破局限：可靈活選擇抗體和染料進(jìn)行搭配組合，解鎖多色流式分析的無限可能。

    簡化流程：簡單三步操作即可制備即用型抗體-染料溶液，實(shí)操時(shí)間不超過 5 分鐘。

    高效穩(wěn)定：單克隆抗體兼?zhèn)涓咛禺愋院涂芍貜?fù)性，凍干粉形式增強(qiáng)運(yùn)輸和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

    潔凈兼容：無防腐劑，兼容的樣品類型更廣。


    ColorWheel® 技術(shù)基于專（禾刂）的寡核苷酸配對(duì)連接技術(shù)將抗體與染料偶聯(lián)起來（詳見圖 3），偶聯(lián)產(chǎn)物與熒光標(biāo)記的直標(biāo)抗體保持一致，可以直接用于流式的標(biāo)記檢測。該技術(shù)的偶聯(lián)過程只需要簡單的 1:1 的混合，其偶聯(lián)過程比起傳統(tǒng)的抗體標(biāo)記方法大大簡化。ColorWheel® 流式抗體的選擇靈活性能讓使用者更加靈活的設(shè)計(jì)多色方案，擺脫由于抗體熒光組合缺失導(dǎo)致的配色困境（詳見表 2）。


    圖片

    圖 3  ColorWheel 流式抗體偶聯(lián)技術(shù)示意


    表 2 Colorwheel® 助力突破傳統(tǒng)多色流式分析的局限

    傳統(tǒng)方法

    傳統(tǒng)方法的局限

    Colorwheel® 方案

    標(biāo)記一抗

    同時(shí)需要目標(biāo)抗體以及與儀器兼容的染料

    支持任意ColorWheel® 抗體和染料的組合，操作更靈活

    標(biāo)記二抗

    需要多次反復(fù)洗滌，存在交叉反應(yīng)性問題

    ColorWheel® 抗體和染料通過 3 步即可完成結(jié)合反應(yīng)，盡可能降低復(fù)雜物種反應(yīng)性和反復(fù)洗滌引起的抗體損失風(fēng)險(xiǎn)

    標(biāo)記試劑盒

    耗費(fèi)更多時(shí)間和成本，并導(dǎo)致數(shù)據(jù)波動(dòng)

    ColorWheel® 抗體和染料無需額外的標(biāo)記試劑盒，既節(jié)省時(shí)間，又節(jié)省成本，并可規(guī)避標(biāo)記步驟帶來的數(shù)據(jù)誤差


    應(yīng)用舉例：


    ColorWheel® 不僅可以簡化流式細(xì)胞分析流程，突破傳統(tǒng)流式分析方案的局限，同時(shí)可以保證在多重指標(biāo)的流式實(shí)驗(yàn)中具有優(yōu)異的表現(xiàn)。


    以下實(shí)驗(yàn)檢測了免疫 T 細(xì)胞檢測常用的指標(biāo) CD3，CD4，CD44，CD45RA，該 4 重指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)用來評(píng)估 CD4+ 輔助型T細(xì)胞的激活狀態(tài)。結(jié)果顯示，ColorWheel® 流式抗體與傳統(tǒng)的流式抗體具有同樣優(yōu)異的表現(xiàn)（詳見圖 4）。


    圖片
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    圖 4 ColorWheel 流式抗體與傳統(tǒng)流式抗體的檢測效果比較（左邊是 ColorWheel® 結(jié)果，右邊是傳統(tǒng)數(shù)據(jù)）



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