解答流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)疑難

1、Q：rh Annexin V R-PE 20 tests是BD公司用于凋亡流式檢測(cè)的試劑盒，產(chǎn)品顯示種屬為人，請(qǐng)問(wèn)能否用于大鼠細(xì)胞的檢測(cè)？

A：可以。因?yàn)锳nnexin V是與PS親和，而PS在不同種屬間應(yīng)該沒(méi)差異。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin V進(jìn)行熒光素（FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

2、Q：用流式作細(xì)胞凋亡為什么跟tunel差別那么大?。?？tunel測(cè)出來(lái)的細(xì)胞凋亡率大概有30%而作流式測(cè)出來(lái)的凋亡率只有2%（陰性對(duì)照0.5%）差別好大啊，用的是beckman公司的Annexin V /PI雙染試劑盒，實(shí)驗(yàn)步驟如下：

（1）胰酶消化貼壁細(xì)胞，加培養(yǎng)基中止，離心1000轉(zhuǎn)5min

（2）吸去上清，PBS0.5ml 重懸細(xì)胞（因?yàn)橐偷絼e處作流式，期間路程約1h，戶外溫度約37度）

（3）然后加入Annexin V /PI各5微升，避光20min，上機(jī)。

請(qǐng)問(wèn)這是什么原因?qū)е碌模?/p>

A：我也用這兩種方法做過(guò)凋亡，是存在兩種方法測(cè)的凋亡率差別有點(diǎn)大，但還沒(méi)有大到你這樣的程度。雙染測(cè)的是凋亡的早期事件PS外翻。TUNEL測(cè)的是凋亡最晚期的事件DNA的片段化。而且TUNEL在檢測(cè)過(guò)程中，把操作損傷細(xì)胞和壞死細(xì)胞當(dāng)作了凋亡細(xì)胞，而且如果TUNEL是肉眼計(jì)數(shù)的話，也會(huì)有判斷上的誤差，所以，往往TUNEL作出來(lái)的凋亡率高一點(diǎn)。但如果凋亡率達(dá)到30%，ladder估計(jì)也應(yīng)該跑的出來(lái)。雙染雖然是機(jī)器操作，但在調(diào)試補(bǔ)償時(shí)，人為的影響還是挺明顯的，也不是特別的客觀。基線稍微左移，你的凋亡率就成倍上升。所以，給你的建議是在經(jīng)費(fèi)、時(shí)間允許的范圍內(nèi)再多做幾次吧。感覺(jué)這么大的差異，可能這兩種方法都會(huì)存在問(wèn)題。還有，去流式的路上，裝細(xì)胞的ep管最好插在冰上，拿著冰盒。

3、Q：可以用液氮保存瘤組織塊，然后再做流式細(xì)胞分析嗎？

A：我認(rèn)為是不能的。因?yàn)榱魇郊?xì)胞分析要求細(xì)胞分散、單個(gè)，活性好，這樣才能區(qū)分死亡、凋亡和活性細(xì)胞。組織在凍存、復(fù)溫的過(guò)程中會(huì)有大量的細(xì)胞死亡，同時(shí)經(jīng)過(guò)這一過(guò)程的組織在分離成單個(gè)細(xì)胞的時(shí)候會(huì)形成許多細(xì)胞碎片，不宜上流式檢測(cè)了，所以用于流式檢測(cè)的標(biāo)本最好是新鮮標(biāo)本，即取材后立即檢測(cè)，效果最（女子）。

我以前也試圖將組織存入-80℃，然后進(jìn)行流式檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)后來(lái)處理的組織細(xì)胞不是粘團(tuán)就是破碎，根本無(wú)法檢測(cè)。如果你實(shí)在找不到可以檢測(cè)的流式細(xì)胞儀，我建議你可以將組織標(biāo)本進(jìn)行切片，然后做原位染色，觀察組織細(xì)胞的凋亡。

我們實(shí)驗(yàn)室的腫瘤組織塊一部分凍存于液氮用于以后提蛋白做Western或提RNA做RT-PCR，另一部分用10%的甲醛固定用于以后做免疫組化。

4、Q：有關(guān)流式前收集細(xì)胞的問(wèn)題1、貼壁細(xì)胞做流式前用胰酶消化下來(lái)對(duì)細(xì)胞膜損傷小還是用細(xì)胞刮刮下來(lái)?yè)p傷?。糠N在板里的貼壁細(xì)胞可以先染PI然后再消化下來(lái)嗎？這樣是否可以減小由于消化液造成的細(xì)胞膜破損而染上的PI的誤差？

A：我想做NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)，用MTT做了很多回，但只有NK細(xì)胞的對(duì)照組OD值就和腫瘤對(duì)照組差不多高了，這樣NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞后自身的變化對(duì)抑制率的影響會(huì)很大，所以想用流式來(lái)測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡。我擔(dān)心胰酶消化會(huì)造成細(xì)胞膜的損傷，這樣就會(huì)有一些細(xì)胞因消化的原因染上PI，所以想嘗試先染PI，洗掉多余的PI后再用胰酶把細(xì)胞消化下來(lái)，不知道可不可以。低濃度胰酶消化，輕柔吹打貼壁細(xì)胞2～3次，吊桶式離心機(jī)4度1000rpm 3～5min離心，處理得當(dāng)?shù)脑?，胰酶造成損傷可以控制在5%以內(nèi)，有對(duì)照組的情況下對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不會(huì)造成明顯影響。而先加PI不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷，而且PI本身對(duì)細(xì)胞也是有毒性的，對(duì)你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響會(huì)比胰酶大，個(gè)人不建議這樣做。

5、Q：做流式細(xì)胞過(guò)程中，由于不能用胰酶消化貼壁細(xì)胞，還有其他什么方法嗎？由于293細(xì)胞貼壁能力很強(qiáng)，現(xiàn)在要做流式，要把貼在培養(yǎng)皿壁上的細(xì)胞消化下來(lái)。但又不能用胰酶消化，我試著用1毫升的1mM的EDTA消化20min，結(jié)果細(xì)胞很難消化下來(lái)。最后，去做流式檢測(cè)結(jié)果很差。不知道還有其他什么更好的消化方法，但又不破壞細(xì)胞膜的表面結(jié)構(gòu)。

A：不是不能用胰酶消化是不能用含有EDTA的胰酶消化，因?yàn)閍nnexinV是Ca依賴的蛋白，所以不能加入EDTA， 防止EDTA螯合了Ca離子從而影響annexinV，進(jìn)而影響結(jié)果。所以你可以用不含EDTA的胰酶，放入溫箱內(nèi)進(jìn)行消化，時(shí)間可以長(zhǎng)一點(diǎn)，隨時(shí)觀察細(xì)胞情況，避免消化過(guò)度。建議用細(xì)胞刮子把細(xì)胞刮下來(lái)，然后用槍吹勻，比消化還簡(jiǎn)單，而且也避免了胰酶帶來(lái)的損傷，機(jī)械的損傷還是很小的因?yàn)榧?xì)胞大多呈大片大片地被刮下來(lái)。

6、Q：流式測(cè)凋亡為何左上象限出奇的高？

A：看了你的數(shù)據(jù)，我覺(jué)得第一跟你的細(xì)胞狀態(tài)很有關(guān)系，你說(shuō)對(duì)照組中間也有很多死細(xì)胞，而且你做實(shí)驗(yàn)時(shí)也吸上來(lái)了，壞死的細(xì)胞和凋亡的細(xì)胞是不一樣的，如果細(xì)胞壞死破裂很多的話這時(shí)左上象限PI就很高了，再則，PI染的時(shí)間5-10分鐘就可以了。我做的時(shí)候是采用PI和Annexin V分開染，PI先染或離心去掉染液，然后再加結(jié)合液和Annexin V10分鐘后上機(jī)檢測(cè)。PBS洗的目的有利于Annexin V的結(jié)合反應(yīng)，為了縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間和較少細(xì)胞損失，我一般也就洗一次。最后，我個(gè)人的觀點(diǎn)是做實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)一定要好的情況下去做，不要勉強(qiáng)，這一既浪費(fèi)試劑和時(shí)間，也往往得不到好的可靠的結(jié)果。你做的是貼壁細(xì)胞，中間有好多死的細(xì)胞，你可以先接種細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁好了，然后再換一次液，這樣就把那些死細(xì)胞去掉，接下來(lái)再加藥物。

7、Q：請(qǐng)教做流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，那種方法比較好？也比較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠？Annexin V/PI雙染色法和Hoechst/PI雙染法哪種更好一點(diǎn)？

A：Hoechst/PI染色在流式分析中并不常見(jiàn)。Hoechst需要紫外激發(fā)，因此只有在配備了相應(yīng)激發(fā)光源的流式細(xì)胞儀上才能使用。我的印象中，不少地方的分選用流式為了用Hoechst分析sp表型的干細(xì)胞，配備了此激發(fā)光源，但是普通的分析用流式，多半是沒(méi)有配備的。

8、Q：流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡如何算是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義？

A：用流式檢測(cè)凋亡時(shí)，PI受時(shí)間的影響很大，因標(biāo)記了PI后會(huì)加大細(xì)胞毒性，隨著時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致PI的染色增加，特別是檢測(cè)早期凋亡時(shí)，如果時(shí)間延長(zhǎng)除了會(huì)導(dǎo)致在流式細(xì)胞儀上的細(xì)胞分群差距加大外，誤差會(huì)明顯加大。一般的說(shuō)明書都會(huì)標(biāo)明，PI在上機(jī)前5分鐘加，然后在一個(gè)小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。根據(jù)以前做流式凋亡時(shí)的經(jīng)驗(yàn)，我個(gè)人認(rèn)為，一般每組實(shí)驗(yàn)一次可以先做三個(gè)復(fù)孔，上機(jī)前5分鐘加PI，最好在半小時(shí)內(nèi)檢測(cè)完畢。這時(shí)可以先分析下三個(gè)復(fù)孔的差異。等待摸索的實(shí)驗(yàn)條件成熟后，每組實(shí)驗(yàn)一次可以做6~8個(gè)復(fù)孔，然后做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。嚴(yán)格說(shuō)來(lái)，當(dāng)做出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí)，這樣的實(shí)驗(yàn)還要重復(fù)三次。但是因檢測(cè)凋亡時(shí)，受細(xì)胞狀態(tài)，PI染色時(shí)間，流式檢測(cè)時(shí)間，以及每次實(shí)驗(yàn)時(shí)的誤差等的影響外，很難保證能夠*重復(fù)出上次的結(jié)果，甚至即使在保證了實(shí)驗(yàn)條件幾乎相同的情況下，每次重復(fù)的差異也會(huì)出現(xiàn)加大的情況。這時(shí)可以適當(dāng)重復(fù)2~3次，盡量使差異減小。

9、Q：如何用Hoechst33342/PI流式檢測(cè)凋亡？

A：標(biāo)記完以后，若用流式檢測(cè)，壞死細(xì)胞與凋亡細(xì)胞的峰形是不一樣的，壞死細(xì)胞呈反拋物線，而凋亡細(xì)胞呈正常，應(yīng)是雙曲線吧，很容易區(qū)分的。關(guān)于PI與Hoechst33342作用：PI、Hoechst33342均可與細(xì)胞核DNA（或RNA）結(jié)合。但是PI不能通過(guò)正常的細(xì)胞膜，Hoechst則為膜通透性的熒光染料，故細(xì)胞在處于壞死或晚期調(diào)亡時(shí)細(xì)胞膜被破壞，這時(shí)可為PI著紅色。正常細(xì)胞和中早期調(diào)亡細(xì)胞均可被Hoechst著色，但是正常細(xì)胞核的Hoechst著色的形態(tài)呈圓形，淡蘭色，內(nèi)有較深的蘭色顆粒；而調(diào)亡細(xì)胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。故PI著色為壞死細(xì)胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調(diào)亡細(xì)胞。

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