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    如何運(yùn)用生物化學(xué)方法檢測細(xì)胞凋亡?

    發(fā)布時(shí)間: 2021-12-10  點(diǎn)擊次數(shù): 1706次

    早期凋亡細(xì)胞及活細(xì)胞的胞膜正常,DNA染料碘化丙錠(PI)拒染,但可被另外一種DNA染料Hoechst342(Ho342)染色;而壞死細(xì)胞的胞膜完整性受到破壞,細(xì)胞不需固定即可被PI染色。凋亡細(xì)胞的胞膜成分亦發(fā)生改變,在凋亡早期,原來位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(PS)遷移至脂雙層外側(cè)。另外,細(xì)胞凋亡時(shí)核酸內(nèi)切酶被激活,首先將DNA切成50~300kb大小的DNA,然后進(jìn)一步將染色質(zhì)裂解成單個(gè)核小體和寡聚核小體,形成180~200bp的DNA的片斷。而壞死細(xì)胞DNA斷裂無規(guī)律性。


    本期小編帶來細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)檢測方法。


    一、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測方法

    原理:在正常細(xì)胞中,磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè),細(xì)胞發(fā)生凋亡最早期,膜磷脂酰絲氨酸(PS)由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè),這一變化早于細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)濃縮、DNA的片斷化和細(xì)胞膜的通透性增加等凋亡現(xiàn)象。


    AnnexinV是一種磷脂結(jié)合蛋白,與磷脂酰絲氨酸有高度親和力,故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此AnnexinV被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。 


    碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細(xì)胞膜,但凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性的增加,PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用,就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來。 


    因此,將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí),PI 則被排除在活細(xì)胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI-)之外,而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被FITC 和PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性(Annexin V+/PI+)。這里推薦ZETA LIFE的Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒,實(shí)驗(yàn)操作中效果相當(dāng)不錯(cuò)。


    檢測方法:1.按照既定程序誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;2.按照說明書配制所需溶液;3.常規(guī)制備單細(xì)胞懸液,用冷PBS洗兩次后,取約5×106個(gè)細(xì)胞,1500rpm離心,棄上清,將細(xì)胞懸浮在400 µl×結(jié)合溶液中;4.將細(xì)胞懸液分成5管,每管約1×106個(gè)細(xì)胞,陰性對(duì)照管不加任何試劑,陽性對(duì)照管加2%多聚甲醛固定30分鐘,用FITC標(biāo)記Annexin V和PI雙染,余下3管,其中1管只加10 µl PI,1管只加5 µl FITC標(biāo)記Annexin V,最后一管加10 µl PI和FITC標(biāo)記Annexin V混合,室溫孵育15分鐘;5.每管各加400 µl 1× 結(jié)合緩沖液上機(jī)檢測。


    注意事項(xiàng):A.確定細(xì)胞凋亡發(fā)生的時(shí)間,PS外翻只發(fā)生在細(xì)胞凋亡早期,建議先觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)后決定取樣檢測時(shí)間;B.由于EDTA會(huì)絡(luò)合Ca2+離子,影響Annexin V與PS的結(jié)合,因此建議不用含EDTA的胰酶消化貼壁細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后可能導(dǎo)致胰酶對(duì)細(xì)胞的進(jìn)一步作用從而導(dǎo)致細(xì)胞的進(jìn)一步凋亡,建議在用胰蛋白酶處理前單獨(dú)收集培養(yǎng)液中懸浮的細(xì)胞,保存在2%的BSA中。

     

    二、磷脂酰絲氨酸單抗(PS)檢測法

    原理:與Annexin V相比,PS的抗體可以直接用來檢測細(xì)胞凋亡過程中PS的外翻,而且靈敏度高,特異性強(qiáng),信號(hào)持續(xù)時(shí)間久,費(fèi)用更低。

     

    三、TUNEL法

    原理:TUNEL的全稱是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling,中文名為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位切口末端標(biāo)記。


    細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過程,染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在Ca 2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下,在核小體單位之間被隨機(jī)切斷,形成180~200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下,將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端,從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測,這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)。


    由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂,因而沒有3’-OH形成,很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后,也可使用DNA聚合酶進(jìn)行缺口翻譯(nick translation),使低分子量的DNA標(biāo)記或染色,然后分析凋亡細(xì)胞。


    TUNEL或缺口翻譯法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法,對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色,能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征,可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測定,并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞,靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測定法要高,因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采用。


    不足之處:

    (1)壞死細(xì)胞亦有DNA裂點(diǎn)形成,也可呈現(xiàn)TUNEL反應(yīng)陽性,因而特異性較差。據(jù)報(bào)道,TUNEL反應(yīng)中壞死細(xì)胞的標(biāo)記量比凋亡細(xì)胞的標(biāo)記量少一個(gè)數(shù)量級(jí)。

    (2)TUNEL結(jié)合免疫組化檢測時(shí),固定過程對(duì)檢測的影響較大,切片的大小、薄厚會(huì)直接影響到固定效果,從而產(chǎn)生結(jié)果的差異。

     

    四、ISOL檢測法

    原理:與TUNEL凋亡檢測法類似,ISOL(In Situ Oligo Ligation,原位寡核苷酸片段連接)也是通過末端標(biāo)記斷裂DNA的方法。但該方法的創(chuàng)新在于利用ISOL方法,在DNA的片段的平端或3’端單個(gè)突出堿基進(jìn)行連接擴(kuò)增,鑒于只有發(fā)生凋亡的細(xì)胞才會(huì)發(fā)生平端或3’端單個(gè)堿基突出,所以ApopTag 過氧化物酶ISOL凋亡檢測試劑盒能夠明確的區(qū)分凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。


    優(yōu)勢:原位特異標(biāo)記,能夠最大限度的降低背景,克服TUNEL法檢測的假陽性,適用于石蠟包埋的組織、冰凍組織、貼壁細(xì)胞以及懸浮細(xì)胞的凋亡檢測。

     

    五、DNA凝膠電泳(DNAladder) 

    凋亡過程中DNA裂解是標(biāo)志細(xì)胞最終走向死亡的不可逆的重要過程,DNA凝膠電泳也曾被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡判定的金標(biāo)準(zhǔn)之一。抽提細(xì)胞的DNA,確定樣品中DNA的量和純度,然后在瓊脂糖凝膠上電泳。正?;罴?xì)胞的DNA凝膠電泳為一條區(qū)帶;細(xì)胞凋亡時(shí),由于DNA被裂解成單個(gè)核小體和寡聚核小體,電泳時(shí)呈現(xiàn)特征性的“階梯狀"(ladder)條帶,壞死細(xì)胞的DNA是被隨機(jī)破壞的,不能形成階梯狀條帶,電泳時(shí)出現(xiàn)類似血涂片的連續(xù)性改變。此方法是判斷細(xì)胞有無凋亡發(fā)生的一種簡便方法,比較適用于體外培養(yǎng)的非增殖性細(xì)胞的檢測。


    缺點(diǎn):

    (1)特異性較差,特征性的180~200bpDNA梯帶的出現(xiàn)并非凋亡所有,另外在某些罕見的情況下細(xì)胞發(fā)生凋亡可無DNA斷裂;

    (2)不能提供單個(gè)細(xì)胞或相關(guān)細(xì)胞的組織學(xué)定位或細(xì)胞分化等凋亡信息;

    (3)不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量,只能進(jìn)行半定量;

    (4)靈敏性較差,要求所測標(biāo)本細(xì)胞數(shù)在1×106以上才能使電泳清晰;

    (5)適用于只含有單一細(xì)胞成分標(biāo)本的測定,對(duì)組織細(xì)胞組成復(fù)雜者,不能確定凋亡發(fā)生于哪類細(xì)胞。

     

    六、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)核小體測定

    ELISA是定量檢測細(xì)胞凋亡的免疫化學(xué)法,其基本原理是利用夾心ELISA方法檢測細(xì)胞凋亡后形成的由組蛋白及DNA的片斷組成的核小體。在微定量板上吸附抗組蛋白抗體,加入細(xì)胞裂解后離心所得的含有核小體的上清液,核小體上的組蛋白與包被的抗組蛋白抗體結(jié)合;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體,與核小體上的DNA結(jié)合;加酶的底物,測光吸收值。此方法敏感性高,所需細(xì)胞數(shù)少,可檢測低至5×102/mL的凋亡細(xì)胞。此外,此方法不需特殊儀器,比較適合基層工作。


    缺點(diǎn):

    (1)不能精確測定凋亡發(fā)生的絕對(duì)量;

    (2)適合單一成分細(xì)胞的檢測,對(duì)于多細(xì)胞成分的組織或細(xì)胞混合物,不能判定凋亡發(fā)生在哪種細(xì)胞;

    (3)不能提供單個(gè)細(xì)胞或相關(guān)細(xì)胞的組織學(xué)定位。



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