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    CAT活性的相-抽提分析法

    發(fā)布時(shí)間： 2021-12-16　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1202次

    材料與儀器

    轉(zhuǎn)染細(xì)胞
    氯霉素 Tris·Cl TMPD 二甲苯
    離心機(jī) 離心管 培養(yǎng)箱

    步驟

    一、來源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞

    1.  按“CAT活性的層析分析法"中的步驟1~5的凍融法，制備哺乳動(dòng)物細(xì)胞提取物。如果用胰蛋白酶消化或制細(xì)胞方法來收集細(xì)胞，則將原位裂解法的步驟1至4用以下的步驟2至4代替。

     
    2.  室溫下，300 g 離心5 min，棄去上清。每107細(xì)胞加入1 ml 低滲緩沖液，離心，棄上清。然后每107細(xì)胞加Triton裂解液200 μl。

    二、來源于植物原生質(zhì)體
     
    1.  室溫下，2 000~4 000 g 離心5 min，將植物原生質(zhì)體細(xì)胞收集于1.5 ml 的微量離心管中，棄去上清。

    2.  往細(xì)胞沉淀加50 μl 低滲緩沖液，在旋渦混合器上劇烈振蕩，將離心管置于-70℃ 15 min以上，或置于干冰/乙醇浴中5 min 以凍結(jié)樣品。融解樣品，在室溫下13 000  g 離心2 min，將上清移入一個(gè)干凈管中。

    3.  對(duì)于分析50 μl 細(xì)胞提取液，配置如下CAT分析混合液
    20 μl  0.01 μCi/μl ［3H］氯霉素
    5 μl  5 mg/ml 丁酰輔(酶)A
    5 μl  2 mol/l Tris·Cl，pH8.0
    20 μl  H2O
     
    4.  對(duì)每組分析，將50 μl CAT分析混合液加入50 μl 細(xì)胞提取液中。37℃溫育30~90 min。
     
    5.  用200 μl 2：1的TMPD/二甲苯劇烈報(bào)蕩提取乙?；穆让顾?，離心并移出上層液相至一只閃爍瓶中。

    6.  樣品中加3~5 ml 閃爍液，計(jì)數(shù)測(cè)定CAT的活性。


    同實(shí)驗(yàn)其他方法

    CAT活性的層析分析法

    1.  100 mm 培養(yǎng)皿中的轉(zhuǎn)染了CAT表達(dá)質(zhì)粒的貼壁細(xì)胞，用PBS洗兩次，每次5 ml每培養(yǎng)皿加入1 ml TEN溶液。將細(xì)胞置于冰浴5 min。   2.  用橡膠

    原位裂解細(xì)胞的CAT分析法

    1.  60 mm 培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)染了CAT表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞，用2 ml PBS洗1次。每培養(yǎng)皿加入2 ml 低滲緩沖液，在室溫下溫育2~5 min。 2.  吸去低滲緩沖液，加入400 μl T

    人生長(zhǎng)激素的放射免疫分析法

    1.  取轉(zhuǎn)染了hGH表達(dá)質(zhì)粒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)液100~500 μl。 2.  加100 μl 培養(yǎng)液或標(biāo)準(zhǔn)品至12 mm×75 mm 圓底試管中。加入100 μl 125I-

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