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    從大規(guī)模裂解物中制備λ噬菌體顆粒實驗

    發(fā)布時間： 2021-12-20　　點擊次數(shù)： 1233次

    原理

    從大規(guī)模培養(yǎng)物中制備的 λ 噬菌體，可在高鹽存在下用聚乙二酵 ( PEG ) 沉淀的辦法從裂解物中回收得到。殘余的細(xì)胞碎片和 PEG 可用氯仿抽提。在進一步純化之前，建議測定噬菌體制備物的得率。

    材料與儀器

    大腸桿菌培養(yǎng)物
    氯仿 NaCl 聚乙二醇 SM 胰 DNaseⅠ
    Sorvall GSA 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)型號 量筒

    步驟

    一、材料

    1. 緩沖液和溶液

    氯仿，NaCl ( 固體），聚乙二醇（PEG 8000)（每 500 ml 培養(yǎng)物大約用 50 g），SM。

    2. 酶和緩沖液

      胰 DNase Ⅰ ( 1 mg/ml)，胰 RNase ( 1 mg/ml ) 于 TE 中（pH 7.6 )。

    3. 離心機和轉(zhuǎn)子

    Sorvall GSA 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)型號。

    4. 專用設(shè)備

    量筒（2 L)。

    5. 載體和菌株

    大腸桿菌培養(yǎng)物，經(jīng) λ 噬菌體感染和裂解。

    二、方法

    用 PEG 沉淀噬菌體顆粒

    1. 將含有 λ 噬菌體的裂解培養(yǎng)物冷卻至室溫，加胰 DNase Ⅰ 和 RNase 至終濃度均為 1 μg/ml，室溫溫育 30 min。

    2. 每 500 ml 培養(yǎng)物加入 29.2 g 固體 NaCl（終濃度為 1 mol/L)，攪拌使其溶解。將培養(yǎng)物冰浴 1 h。

    再用 PEG 沉淀噬菌體顆粒中，NaCl 的加入促進了噬菌體顆粒與細(xì)胞碎片之間的分離，因此是有效沉淀所需的。一些研究人員喜歡在加入 PEG 的同時加入 NaCl，那樣的話步驟 3 的離心過程可被省略。但需要告知的是，只有當(dāng)噬菌體生長良好且其在最初裂解培養(yǎng)物中的滴度大于 2X1010 pfu/mI 時，PEG 和 NaCl 的同時加入才能有效地沉淀噬菌體顆粒。

    3. 4℃，11000 g ( 8300 r/min 于 Sorvall GSA 轉(zhuǎn)子中）離心 10 min 以去除細(xì)胞碎片，將四份培養(yǎng)物的上清混合置于 2 L 的干凈量筒中。

    4. 測定所收集上清的總體積，然后轉(zhuǎn)移至 2 L 的燒瓶中，加固體 PEG 至終濃度為 10% (m/V，如 500 ml 上清加 50 g PEG)，于室溫用磁力攪拌器慢慢攪拌溶解 PEG。

    5. 將噬菌體/PEG 溶液轉(zhuǎn)移至聚丙烯離心管中，于冰水浴冷卻，至少放置 1 h 以便使噬菌體顆粒發(fā)生沉淀。

    6. 4℃，11000 g ( 8300 r/min 于 Sorvall GSA 轉(zhuǎn)子中）離心 10 min 以回收沉淀的噬菌體，去上清，將離心管倒過來傾斜放置 5 min，以便使剩余液體充分流干。用移液器吸去殘余的液體。

    用氯仿抽提細(xì)菌碎片

    7. 用一帶橡皮球的寬口吸管將噬菌體沉淀輕輕地重懸于 SM 中（針對步驟 3 每 500 ml 上清加 8 ml SM)，將離心管傾斜放置，使 SM *覆蓋并浸泡噬菌體沉淀，室溫放置 1 h。

    *但溫和地沖洗整個離心管壁，因為噬菌體沉淀會黏附在管壁上，尤其當(dāng)離心管比較陳舊有凹痕時。而如果劇烈地吸取噬菌體，容易造成其尾部的斷裂。

    8. 通過加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸浮液中的 PEG 和細(xì)胞碎片，溫和振蕩 30 s。4℃，3000 g（4300 r/min 于 Sorvall GSA 轉(zhuǎn)子中）離心 15 min 以分離有機相和親水相，回收含噬菌體顆粒的親水相。

    為了測定得率，用凝膠電泳分析噬菌體懸浮液。

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