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    純化的RNA的點(diǎn)雜交和狹線(xiàn)雜交

    發(fā)布時(shí)間： 2021-12-21　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1062次

    原理

    點(diǎn)雜交和狹線(xiàn)雜交技術(shù)（Kafatos et al. 1979) 用于在同一固相支持物（通常為帶電荷的尼龍膜）上固定幾種核酸樣品，然后用合適的探針與已固定的樣品雜交，并由此判斷靶序列的濃度。通過(guò)估計(jì)樣品點(diǎn)發(fā)射出 的信號(hào)的強(qiáng)度，與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品信號(hào)強(qiáng)度 進(jìn)行比較，確定待測(cè)樣品中靶序列的量。

    材料與儀器

    RNA 檢測(cè)樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照 探針標(biāo)記與變性
    NaOH 預(yù)雜交液 RNA 變性液 SSC
    印跡裝置 絞鏈儀 帶正電荷尼龍膜 厚印透紙 水浴鍋

    步驟

    一、材料

    1. 緩沖液與溶液

    NaOH ( 10 mol/L)

    預(yù)雜交液

    RNA 變性液

    0.1X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)

    0.1X SSC ( 含 1%SDS，m/V)

    0.5X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)

    1X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)

    2X SSC

    20X SSC

    2. 核酸與寡聚核甘酸

    RNA 檢測(cè)樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照

    3. 探針

    探針標(biāo)記與變性

    4. 專(zhuān)用設(shè)備

    印跡裝置

    絞鏈儀（如 Stratalinker, Stratagene; GS Gene Linker, Bio-rad) 或真空爐、微波爐

    帶正電荷尼龍膜

    厚印透紙（如 Whatman 3 MM, Schleicher&Schuell GB004, 或 Sigma QuickDraw)

    預(yù)熱水浴鍋到 68℃

    二、方法

    安裝印跡裝置

    1. 切一張合適大小的帶正電荷尼龍膜。用鉛筆標(biāo)上表示方向的記號(hào)。用水把膜簡(jiǎn)單弄濕，在 20X SSC 中室溫泡 1 h。

    2. 在膜浸泡期間，先用 0.1 mol/L NaOH 小心清洗印跡裝置，再用無(wú)菌水洗干凈。

    3. 把兩片厚濾紙用 20X SSC 浸濕，再放到真空器頂部。

    4. 把樣品槽插入裝置的上部，把濕尼龍膜放在樣品槽加樣孔的底部，用吸管在膜的表面滾動(dòng)以去除膜與裝置夾層中的氣泡。

    5. 加緊夾板，連接真空管。

    6. 加入 10X SSC 直至液面沒(méi)過(guò)尼龍膜，關(guān)掉真空，再用 10X SSC 充滿(mǎn)。

    RNA 樣品準(zhǔn)備

    7. 把每個(gè) RNA 樣品（溶解在 10 μl 水）分別與 30 μl RNA 變性液混合。

    8. 65℃ 溫育 5 min，然后在冰上冷卻。

    9. 向每個(gè)樣品中加入等體積 20X SSC。

    10. 輕輕向印跡裝置中吸入 10XSSC，直到淹沒(méi)尼龍膜。

    RNA 樣品的印跡和 RNA 在膜上的固定

    11. 把所有樣品輕輕加入狹線(xiàn)中，然后輕輕吸干膜。當(dāng)所有樣品都鋪到膜上后，每個(gè)狹線(xiàn)用 1 ml 10XSSC 洗兩次。

    12. 當(dāng)?shù)诙蜗茨ね瓿珊?，繼續(xù)輕輕吸干膜。

    13. 取下膜，然后用紫外交聯(lián)、烘烤或微波照射把 RNA 固定在膜上。

    固定化 RNA 的雜交與洗膜

    14. 把膜放入烤盤(pán)或雜交爐中，加入 10~20 ml 預(yù)雜交液 68℃ 溫育 2 h。

    15. 把已變性的放射性標(biāo)記的探針直接加到預(yù)雜交液中。在適當(dāng)?shù)臏囟认吕^續(xù)溫育 12~16 h。

    16. 雜交完后從塑料袋中取出膜，然后盡可能快地把膜轉(zhuǎn)移到室溫下裝有 100~200 mJ、1X SSC ( 0.1% SDS) 的塑料容器中。蓋緊塑料容器，放到搖床上輕搖 10 min。

    17. 把膜轉(zhuǎn)移到另一個(gè)裝有 100~200 ml 的、預(yù)熱到 68℃ 的 0.5X SSC ( 含 0.1% SDS) 的塑料袋中，然后在此溫度下輕搖 10 min。

    18. 按步驟 17 重復(fù)洗膜兩次，使總的洗膜次數(shù)達(dá)到三次。

    19. 用濾紙吸干膜，在 -70℃ 條件下放射自顯影 24~48 h ( Kodak XAR-5 或相當(dāng)?shù)哪z片)。鎢酸鹽型的增感屏比舊式稀土型的效果更好。當(dāng)然，磷光成像儀也可以用來(lái)成像。

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