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    細(xì)胞的必須檢查，你有做過嗎？

    發(fā)布時(shí)間： 2022-01-04　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1138次

    文章描述了一個(gè)典型的工作流程，與細(xì)胞操作需要注意的必要步驟，為了成功地應(yīng)用哺乳動物細(xì)胞系，它們必須在受控的條件下生長，并需要自己特定的生長介質(zhì)。此外，為了保證一致性，必須定期監(jiān)測它們的生長情況。當(dāng)細(xì)胞系達(dá)到約80%的合流時(shí)，必須傳代培養(yǎng)，以確保細(xì)胞的正常生長和健康。80%的重合性是指培養(yǎng)容器表面的80%被細(xì)胞覆蓋。



    01

    為什么我需要傳代我的細(xì)胞？                      


    細(xì)胞培養(yǎng)一旦開始，由于細(xì)胞數(shù)量的增加、營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和有毒代謝物的增加，它不能無限期地生長，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，研究人員通常對細(xì)胞要進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，因此不希望一次用完所有的細(xì)胞。傳代或分裂細(xì)胞，通過去除培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移細(xì)胞到新鮮的生長培養(yǎng)基，細(xì)胞被給予新鮮的營養(yǎng)同事有毒的代謝物也被去除，細(xì)胞就會被賦予新的活力繼續(xù)生長。



    02

    細(xì)胞生長曲線                                            



    細(xì)胞在培養(yǎng)液中的生長曲線由四個(gè)階段組成:生長開始前的潛伏期(滯后期)，指數(shù)生長期(對數(shù)期)，細(xì)胞數(shù)量快速增長逐漸放緩的平穩(wěn)期和細(xì)胞死亡的死亡期，這是因?yàn)槿狈I養(yǎng)和錯誤的生存條件。在對數(shù)期應(yīng)更換培養(yǎng)基，細(xì)胞在到達(dá)固定期前應(yīng)進(jìn)行傳代，如圖1.


    圖一


    所以培養(yǎng)細(xì)胞的同學(xué)請注意：

    為了保持細(xì)胞的健康和積極生長，有必要更新生長培養(yǎng)基，并定期傳代。根據(jù)細(xì)胞類型的不同，培養(yǎng)基在對數(shù)期可以發(fā)生幾次改變。傳代細(xì)胞的最佳時(shí)間是在對數(shù)期和固定期之間，即細(xì)胞達(dá)到合流之前。

     


    一. 為什么用胰酶傳代細(xì)胞？


    準(zhǔn)備細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)的最常見方法是用胰蛋白酶等蛋白水解酶破壞細(xì)胞間的細(xì)胞與底物的連接。胰蛋白酶與乙二胺四乙酸(EDTA)結(jié)合會導(dǎo)致細(xì)胞從生長表面脫離。胰蛋白酶切斷將細(xì)胞固定在培養(yǎng)皿上的局部粘連，EDTA作為鈣螯合劑。

     

    通過去除鈣，參與細(xì)胞間相互作用的鈣粘蛋白被破壞，細(xì)胞彼此分離。一旦從生長表面和周圍細(xì)胞分離，就可以很容易地分離并在新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中生長。

      

    細(xì)胞培養(yǎng)條件和傳代培養(yǎng)方法因細(xì)胞類型而異。圖2描述了細(xì)胞培養(yǎng)過程中的基本步驟。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，在一個(gè)無污染的環(huán)境中工作是很重要的。在開始、胰蛋白酶化、細(xì)胞計(jì)數(shù)和分裂后都要檢查細(xì)胞。為了取得一致的結(jié)果，保持良好的記錄和文件也很重要。

    圖二


    二. 3個(gè)步驟確定細(xì)胞是否能夠傳代

    ①. 將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，置于顯微鏡下進(jìn)行快速細(xì)胞檢查。細(xì)胞應(yīng)該每天在顯微鏡下檢查，以確保它們是健康的(沒有污染，很少死細(xì)胞)和生長如預(yù)期。

    ②. 細(xì)胞應(yīng)主要附著在培養(yǎng)皿或燒瓶的底部，而培養(yǎng)基應(yīng)是粉橘色。pH值指示物酚紅在酸化時(shí)變成黃色，這個(gè)時(shí)候需要注意了 ，有兩種情況 一是細(xì)胞的密度過大，已經(jīng)到了生長平頂期，二是細(xì)胞里有污染物。

    ③. 用顯微鏡拍照，記錄好細(xì)胞狀態(tài)對于保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性非常重要。



    三. 傳代我的細(xì)胞

    ①. 移液器將培養(yǎng)基從細(xì)胞皿移到廢物容器中。用5ml不含鈣和鎂的預(yù)加熱PBS仔細(xì)清洗細(xì)胞多達(dá)三次，以去除殘留培養(yǎng)基中的胎牛血清(FBS)。胎牛血清會抑制胰蛋白酶。

    ②. 加入相應(yīng)規(guī)格的預(yù)溫胰蛋白酶/EDTA ，比如：T25瓶 1-2ml左右，輕輕旋轉(zhuǎn)以覆蓋培養(yǎng)皿底部的所有細(xì)胞。

    ③. 將細(xì)胞在37°C孵育2-3分鐘或者室溫3-5分鐘使其分離。不同的細(xì)胞系需要不同的胰蛋白酶孵育時(shí)間。為避免過度胰蛋白酶作用損傷細(xì)胞，每隔2分鐘在顯微鏡下檢查一次。待細(xì)胞變得橢圓透亮后，caco-2/hepG2細(xì)胞邊緣開始漂浮時(shí)，加雙倍以上*培養(yǎng)基中和，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15ml的試管中，并以1000轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)5min。

    ④. 抽吸上清，加2ml*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，分瓶或者凍存。





    四. 細(xì)胞計(jì)數(shù)：


    ①. 將100µL細(xì)胞懸液與等量的0.4%臺盼藍(lán)溶液混合。臺盼藍(lán)可以選擇性地穿透死細(xì)胞的細(xì)胞膜并將其染成藍(lán)色，但不會被活細(xì)胞吸收。將蓋片置于計(jì)數(shù)面上，準(zhǔn)備血細(xì)胞計(jì)。

    ②. 將移液管尖的一端置于蓋玻片邊緣，將細(xì)胞懸浮液裝入計(jì)數(shù)室(每個(gè)計(jì)數(shù)面積約為4µl)，輕輕排出細(xì)胞懸浮液。蓋層下的區(qū)域通過毛細(xì)作用而淤塞。在大多數(shù)情況下，腔室有兩個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)，可以獨(dú)立加載。

    ③. 將腔室置于顯微鏡臺上，聚焦細(xì)胞。計(jì)數(shù)柵的方形圖案因腔體類型的不同而不同。你在這里看到的福克斯-羅森塔爾計(jì)數(shù)室有16個(gè)面積為一平方毫米的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域由三道線圍成。每個(gè)方塊又被分成16個(gè)更小的方塊。計(jì)算一個(gè)16平方區(qū)域中的所有單元格，如圖所示。為了避免在區(qū)域的邊緣計(jì)算兩次單元格，只計(jì)算正方形兩邊直線上的那些單元格。在本例中，應(yīng)計(jì)算觸及左上界限的單元格(較粗的紅線)。細(xì)胞觸及的下限值和右限值不應(yīng)被考慮在內(nèi)。將活細(xì)胞和死細(xì)胞按5個(gè)一平方毫米的矩形計(jì)數(shù)。為了進(jìn)行計(jì)算，您需要將所有5個(gè)正方形的計(jì)數(shù)結(jié)果結(jié)合起來。為了提高測量精度，還可以計(jì)算計(jì)數(shù)室的額外平方.


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