細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)全步驟解析

用BD公司的Matrigel 1:8或者根據(jù)細(xì)胞產(chǎn)生mmp的量來決定稀釋,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進(jìn)行基底膜水化。

制備細(xì)胞懸液前可先用基礎(chǔ)培養(yǎng)基加1%的血清培養(yǎng)細(xì)胞，讓細(xì)胞饑餓12-24h,進(jìn)一步去除血清的影響。

消化細(xì)胞,終止消化后離心棄去培養(yǎng)液,(用PBS洗1-2遍),用含0.1%的BSA的無血清培養(yǎng)基重懸及調(diào)整密度，通常調(diào)整細(xì)胞密度至5×10^5cells/ml。

取細(xì)胞懸液100μl加入Transwell上室,　也可以根據(jù)細(xì)胞生長速度進(jìn)行調(diào)整，操作小提示：接種劑量不同的細(xì)胞，其侵襲能力是不同的，細(xì)胞量過多，穿過膜的細(xì)胞會(huì)過多過快，最后會(huì)難以統(tǒng)計(jì)結(jié)果;而細(xì)胞量過少，可能還沒到檢測的時(shí)間點(diǎn)，所有的細(xì)胞都已穿過，進(jìn)入下室。因此最少也要保證在收樣的時(shí)候，上室內(nèi)還要有一定量的細(xì)胞存在。

24孔板下室一般加入600μl含生長因子或血清的*培養(yǎng)基,特別注意的是,下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生,一旦產(chǎn)生氣泡,下層培養(yǎng)液的趨化作用就會(huì)減弱甚至消失,種板時(shí)一旦出現(xiàn)氣泡,要將小室提起去除完氣泡,再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。若是平行孔，一般設(shè)置兩組.

培養(yǎng)細(xì)胞:常規(guī)培養(yǎng)12-48h(主要依細(xì)胞侵襲能力而定)。24h較常見,時(shí)間節(jié)點(diǎn)的設(shè)置除了要考慮到細(xì)胞的侵襲力外,處理因素以及細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。

采用直接計(jì)數(shù)法,取出Transwell小室,棄去孔中培養(yǎng)液,用無鈣的PBS洗2遍,甲醇固定30分鐘,將小室適當(dāng)風(fēng)干。

 0.1%結(jié)晶紫染色20 min,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞,注意不要蹭到已穿膜的那一層細(xì)胞，之后再用PBS洗3遍。

400倍顯微鏡下每個(gè)樣本取6-10個(gè)視野觀察細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值，統(tǒng)計(jì)分析。