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    單層細胞的傳代

    發(fā)布時間： 2022-12-05　　點擊次數(shù)： 805次

    原理

    去除培養(yǎng)基，加人胰蛋白酶短暫作用，孵育，以培養(yǎng)基分散細胞，計數(shù)，稀釋并再接種。

    材料與儀器

    A549細胞 WI-38 MRC-5 胰蛋白酶 D-PBS
    70%乙醇噴壺
    生長培養(yǎng)基 吸管 離心管 培養(yǎng)瓶 移液器 吸耳球 吸水紙巾 吸管桶 抗乙醇記號筆 血細胞計數(shù)板

    步驟

    1. 準備超凈工作臺，將試劑及材料置于超凈臺，開始實驗。

    2. 仔細檢査培養(yǎng)物有無污染或衰退跡象。

    3. 依據(jù)標準和你對該培養(yǎng)物行為的了解，決定是否需要傳代（做練習(xí) 13者應(yīng)記錄細胞密度和狀態(tài)，如有絲分裂、多層、細胞變性）。若需要傳代，如下進行。

    4. 將培養(yǎng)物置于無菌工作區(qū)域，除棄舊培養(yǎng)基。各種細胞（A 549細胞，以 2×104 /ml 接種在 25 cm2 培養(yǎng)瓶中7 天和14天；WI-38，MRC-5，或同樣正常二倍體成纖維細胞，以 2×104 /ml 接種在 25 cm2 培養(yǎng)瓶中7 天和14天）分開進行，每種細胞均重復(fù)從此以下步驟。

    5. 為避免沖散細胞，沿培養(yǎng)瓶細胞面對側(cè)加人 D-PBS/EDTA  ( 0.2 ml/cm2）（D-PBS 含 1 mmol/L EDTA），清洗細胞，去除預(yù)洗液。這一步驟的目的在于去除殘留血清，因為血清可抑制胰蛋白酶的作用，去除細胞黏附所需的二價陽離子。

    6. 沿培養(yǎng)瓶細胞對側(cè)面加入胰蛋白酶（0.1 ml/cm2 )（0.25 % ，D-PBS 配置）。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶平放。確保胰蛋白酶全部覆蓋細胞層。靜置 15~30 s。

    7. 立起培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶離開細胞層，快速檢査單層細胞是否尚未脫落。如果細胞未解離即脫壁就成問題，使用 4°C 胰蛋白酶可以防止該問題發(fā)生。

    8. 吸走大部分胰蛋白酶，只留數(shù)滴。

    9. 平置培養(yǎng)瓶孵育，直至細胞變圓隆起，傾斜培養(yǎng)瓶，單層細胞就會從培養(yǎng)瓶表面滑落（通常發(fā)生在 5~15 min 以后）。注意不要消化時間過長，另一方面也不要在細胞消化好前強制將細胞吹打下來，這樣將導(dǎo)致細胞成片脫落。

    10. 加人培養(yǎng)液（0.1~0.2 ml/cm2 )，反復(fù)以吸管（吸管，帶刻度、塞棉花。如果是玻璃的，根據(jù)大小置于方細胞盒中，如果是塑料的，單個包裝，分類放在架子上，用于吸除培養(yǎng)液的未塞棉花吸管，如果有泵和真空吸引管道的話）吹打單層培養(yǎng)細胞面以分散細胞。

    11. 最后，將吸管的尖（立耑）放于培養(yǎng)瓶底角，上下吹打細胞幾次，注意不要產(chǎn)生氣泡。吹打的強度各個細胞系有所不同，有的細胞系很容易分散，而有的則需大力吹打才能分散。但若吹打力量過大幾乎所有的細胞都會受到剪切力的機械損傷。原代或早期幾代培養(yǎng)的細胞由于它們較脆弱和體積較大而尤其容易受到損傷，而連續(xù)細胞系通常有較大彈性，需要大力吹打才能全部解離。充分上下吹打以分散細胞使之處于單細胞懸浮狀態(tài)。若這一步驟進行困難，選用更強的解離試劑。
    傳代過程中單細胞懸液是較理想的，它有助于保證細胞的計數(shù)準確和再接種后均一性生長。若要進行細胞增殖或貼瓶率的計數(shù)或進行細胞克隆分離，制備單細胞懸液是必需的。

    12. 用血細胞計數(shù)板或電子細胞計數(shù)儀計數(shù)細胞并記錄數(shù)值。

    13. 稀釋懸液直至合適的接種濃度。

    (a) 加人適量細胞懸液到已有已知體積培養(yǎng)基（生長培養(yǎng)基，如1× MEM 加 Earle 鹽、23 mmol/L NaHCO3，無抗生素）的培養(yǎng)瓶中，或

    (b) 稀釋細胞至所需的總體積，然后再分裝到各個培養(yǎng)瓶中。

    程序(a)適合常規(guī)傳代，傳瓶數(shù)不多且不需要準確的細胞計數(shù)和增殖能力測定，但若同時做多個相同的培養(yǎng)，程序(b)則更適合。因為操作的次數(shù)減少，每一培養(yǎng)瓶中細胞密度全部一致。

    對于練習(xí)13 , 用(b)程序：用 20 ml 培養(yǎng)液稀釋各瓶的細胞至 2×104/ml, 從每瓶細胞懸液中取 5 ml, 接種到 2 個培養(yǎng)瓶中。

    14. 如果細胞在提高 CO2 的情況下（如材料中所列的 Eagle MEM 含 Earle’s 鹽和 23 mmol/L NaHCO3）生長，則從提前混合好的混合氣體瓶或氣體混合裝置通過過濾管注人正確的氣體（此次是 5 % CO2）至培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基上面供氣。注意不要將氣體吹入培養(yǎng)基內(nèi)，那樣會產(chǎn)生氣泡，氣泡可能使培養(yǎng)基的某些成分變質(zhì)，同時也會增加污染的兒率。如果正常氣相是空氣，用含 Hank 鹽的 Eagle MEM 培養(yǎng)基，這一步驟可以省略。

    15. 蓋上培養(yǎng)瓶，放回孵箱中，大約一小時后檢查 pH 的變化。若在空氣相中培養(yǎng)基 pH 升高，則要將培養(yǎng)瓶移至無菌區(qū)域內(nèi)，向其中快速（1~2 s ) 吹入 5 % CO2 。因為每一培養(yǎng)物的行為在相同的培養(yǎng)基中是已知的，最終會清楚傳代時哪種細胞需要吹氣，而不必首先孵育觀察。如果在 5 % CO2 氣相中培養(yǎng)基的 pH 還是升高（如本實驗），可以增加 CO2 濃度至 7 % 或 10 % 或者加人無菌的 0.1 mol/L 的 HCl。

    16. 從操作步驟 4 重復(fù)本程序，對第二個細胞系進行傳代。

    注意事項

    在每種情況下， 主要的解離試劑， 不論是胰蛋白酶或是 EDTA , 僅做短暫停留， 去除大部分消化液后， 僅留少量消化液進行孵育。如果在分離細胞以及后續(xù)制備單細胞懸液過程中遇到困難， 可采用其他程序。

    常見問題

    本程序第 15 步不可作為傳代后 pH 升高這一問題的長期解決辦法，若問題持續(xù)存在，則在配置培養(yǎng)基時降低其 pH，同時檢查在孵箱中或充氣的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基的 pH。


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