PEG 介導(dǎo)的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合

（一）試劑配制

（1）HAT 選擇培養(yǎng)液 常用兩種儲(chǔ)存液（100xHT 和 100xA）來(lái)稀釋配制 HAT 培養(yǎng)液。

① 100xHT 稱取次黃-嘌-呤 136.1 mg 和胸腺嘧啶核苷 38.8 mg，加細(xì)胞培養(yǎng)用水至 100 ml。若溶解不佳，加熱（70 ℃）助溶。100 倍儲(chǔ)存液中，次黃-嘌-呤濃度為 10 mmol/L，胸苷為 1.6 mmol/L。0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌，分裝，-20 ℃ 保存，可保存 1 年。

② 100xA 稱取氨基蝶呤 1.76 mg，溶解于細(xì)胞培養(yǎng)用水中。加 1.0 mol/L NaOH 0.5 ml 助溶，再用 1 mol/L HC1 將 pH 調(diào)回至中性，定容至 100 ml。注意勿調(diào)成酸性，因?yàn)榘被蕦?duì)酸敏感。100 倍儲(chǔ)存液中氨基蝶呤的濃度為 0.04 mmol/L。0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌，分裝，-20 ℃ 保存，可保存 1 年。

③ 將 100xHT 和 100xA 各按 1:100 比例加到含小牛血清的完-全培養(yǎng)基中，即成 HAT 選擇培養(yǎng)液。其中各成分的最終濃度分別為：H,1x10-4 mol/L;A,4x10-7 mol/L;T,1.6x10-5 mol/L。 

（2）100xHT 培養(yǎng)液 10 mmol/L 次黃-嘌-呤鈉鹽；1.6 mmol/L 胸腺嘧啶脫氧核苷。

（二）準(zhǔn)備脾細(xì)胞

（1）處死動(dòng)物并用乙醇擦拭腹部，剖開(kāi)腹部暴露脾臟。

（2）用滅菌的鑷子和剪刀取出脾臟，置于一盛有 50 ml 滅菌 PBS 的燒杯中，洗去血污。

（3）把脾臟移入一盛有 20 ml 滅菌 PBS 的培養(yǎng)皿中。除去所有的多余組織和脂肪，并用 PBS 沖洗脾臟。

（4）把脾臟移入盛有 20 ml 滅菌 PBS 的培養(yǎng)皿，用滅菌的剪刀、鑷子剪碎組織，制成單細(xì)胞懸液。

（5）收集細(xì)胞于 50 ml 離心管，用 10 ml 滅菌的 PBS 清洗培養(yǎng)皿并轉(zhuǎn)移入離心管。靜置 1 min。

（6）小心把細(xì)胞懸液移入一新的離心管，不要讓管底的組織塊一并轉(zhuǎn)入。

（7）用 10 ml 滅菌的 PBS 清洗有組織塊的離心管，靜置 1 min 后小心移出細(xì)胞懸液，并和上一次的細(xì)胞懸液混合。

（8）室溫下以 800 g 離心 5 min。

（9）小心棄上清液。用 50 ml 滅菌的 PBS 重懸細(xì)胞，重復(fù)離心。

（10）小心棄上清液。在 10 ml 滅菌的 PBS 中重懸細(xì)胞。

（11）取 1 滴進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

（三）準(zhǔn)備骨髓瘤細(xì)胞

（1）從 2～4 個(gè)培養(yǎng)瓶中收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞。

（2）用滅菌的 PBS 清洗細(xì)胞，800 g 離心 5 min。

（3）重復(fù)洗滌、離心一次。

（4）用 10 ml 滅菌的 PBS 重懸細(xì)胞。

（5）取 1 滴進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

（四）融合步驟

（1）以 3:1～5:1（脾細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞）的比例在 50 ml 離心管中混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞（細(xì)胞總數(shù)約為 106）。室溫下 800 g 離心 5 min。

（2）盡可能地棄去上清液。輕叩管底使沉淀松動(dòng)，置 37 ℃（39 ℃ 更佳）水浴中預(yù)溫。

（3）緩慢逐滴加入 1 ml 37 ℃ 預(yù)溫的 50％ PEG 溶液，邊加邊輕搖混勻，加完后用吸管輕輕吹打混勻。37 ℃ 靜置 1 min。

（4）用 20 ml 滅菌的 PBS 稀釋 PEG。注意動(dòng)作一定要緩慢，尤其是開(kāi)始稀釋時(shí)（最初 1 ml 在 1 min 內(nèi)加完，之后可加快速度）。800 g 離心 5 min，棄上清液。

（5）重復(fù)洗滌、離心一次。

（6）棄上清。在 HAT 培養(yǎng)液中重懸沉淀，使細(xì)胞密度為 5x105 個(gè)/ml

（7）轉(zhuǎn)入 96 孔培養(yǎng)板，每孔 0.2 ml。在 CO2 培養(yǎng)箱中 37 ℃ 培養(yǎng)

 5～7 d，其間根據(jù)需要換 HAT 培養(yǎng)液。

（8）觀察細(xì)胞融合結(jié)果。