Trizol法和柱式法RNA提取的實(shí)驗(yàn)流程和注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)原理：

（一）Trizol 法

Trizol是一種酸性試劑，能從細(xì)胞和組織中快速分離RNA，其主要成分為異硫氰酸胍（GITC）和苯酚。裂解細(xì)胞后，GITC能使蛋白質(zhì)和RNase變性，有利于保護(hù)RNA的完整性；加入氯仿離心后，樣品分為水相和有機(jī)相，RNA存在于上層水相中，而DNA和蛋白質(zhì)則存在于中間層及下層有機(jī)相中，從而達(dá)到分離的目的。簡(jiǎn)單來(lái)講就是裂解細(xì)胞使RNA得以釋放，加之有機(jī)溶劑使RNA與DNA、蛋白質(zhì)分離，并進(jìn)一步純化得到RNA的過(guò)程。

試劑、儀器與耗材：

Trizol試劑、氯仿、異丙醇、75%乙醇、RNase free Water、低溫冷凍離心機(jī)、勻漿器或組織研磨器、渦旋振蕩器、金屬浴、微量移液器、通風(fēng)櫥、計(jì)時(shí)器、1.5ml EP管等。

提取步驟：

1.樣品處理：

細(xì)胞：貼壁細(xì)胞每106細(xì)胞加入1ml裂解液，吹打混勻。

懸浮細(xì)胞：植物、動(dòng)物、酵母每10^6細(xì)胞加入1ml裂解液。

細(xì)菌細(xì)胞每107細(xì)胞加入1ml裂解液混勻。

組織：新鮮或-70℃凍存100mg組織加1ml裂解液，勻漿處理。

2.室溫放置5min，使核酸蛋白復(fù)合物全部分離；

3.向勻漿樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置3-5min；

4.2-8℃，12000rpm離心10min。RNA主要存在于上層水相中把水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中（注：不可吸到沉淀）；

5.吸附柱前處理：在吸附柱中加入500ul洗柱液，室溫放置2min，2-8℃，12000rpm離心2min，棄廢液（小Tips：此步可以在第四步離心還剩2min左右的時(shí)候進(jìn)行，這樣第四步離心結(jié)束就可以直接進(jìn)行洗柱，而不需要再等時(shí)間）；

6.在收集的上清中加入200ul無(wú)水乙醇混勻，加入吸附柱中靜置2min，2-8℃，12000rpm離心2min，棄廢液；

7.向吸附柱中加入600ul漂洗液（注：新買的試劑盒中漂洗液還需要加入一定量的無(wú)水乙醇，此步一定要確認(rèn)漂洗液是否加入無(wú)水乙醇），2-8℃，12000rpm離心2min，棄廢液；

8.向吸附柱中加入600ul漂洗液，2-8℃，12000rpm離心2min，棄廢液（注：漂洗液在7-8步共加了兩次哦）；

9.12000rpm離心2min，棄掉收集管，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘（10-15min）以去除殘留的漂洗液（注：最好在通風(fēng)櫥進(jìn)行，以免RNA酶對(duì)RNA的降解；通風(fēng)櫥在使用前也可先紫外30min）；

10.將吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O（通常取中間值），室溫放置5min，12000rpm室溫離心2min即可得到RNA溶液（注：所有步驟中僅最后一步離心是在室溫，其余均在2-8℃，因此，前幾步離心拿出樣品后一定要及時(shí)關(guān)上離心機(jī)蓋子，以免升溫，而在第9步離心結(jié)束后就可以打開離心機(jī)蓋子使其快速升至室溫）。

四、 注意事項(xiàng)

1．佩戴手套、口罩，消毒操作臺(tái)，杜絕外源酶的污染；

2．所用試劑耗材必須無(wú)酶化，有條件者可以直接購(gòu)買，否則就要做好高壓滅菌的工作；

3．得到RNA溶液后可保存于-80℃，避免反復(fù)凍融，放置時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)；

4．對(duì)于組織RNA的提取，一定要充分勻漿處理以使RNA充分釋放出來(lái)。

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