蛋白質(zhì)互作研究方法

相當(dāng)多的蛋白質(zhì)行使功能的時(shí)候并不是單打獨(dú)斗的，蛋白質(zhì)們通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用形成復(fù)合體然后進(jìn)行工作。因此，研究蛋白質(zhì)的相互作用成為研究蛋白質(zhì)功能和作用機(jī)制的最為重要的環(huán)節(jié)之一。

1.酵母雙雜交系統(tǒng)

原理：很多真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可分割開的結(jié)構(gòu)域，即DNA特異結(jié)合域（DNA-binding domain,BD)與轉(zhuǎn)錄激活域（Transcriptional activationdomain, AD）。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響，但一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，否則無(wú)法完成激活功能。

將兩待測(cè)研究蛋白（蛋白X與蛋白Y）分別與BD、AD結(jié)構(gòu)域構(gòu)建融合質(zhì)粒。將構(gòu)建好的兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一酵母細(xì)胞中表達(dá)，如果兩蛋白之間不存在相互作用，則下游基因（報(bào)告基因）不會(huì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)；如果兩個(gè)蛋白存在相互作用，則BD與AD兩結(jié)構(gòu)域空間上很接近，從而下游基因（報(bào)告基因）得到轉(zhuǎn)錄。判斷通過(guò)報(bào)告基因表達(dá)與否，即可判斷兩蛋白之間是否存在相互作用。

用酵母雙雜交系統(tǒng)能夠快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用，并能尋找、分離與已知蛋白相互作用的配體，在研究抗原和抗體相互作用、發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的新功能、篩選藥物作用位點(diǎn)及藥物對(duì)蛋白互作影響、建立基因組蛋白連鎖圖等方面應(yīng)用廣泛。

2.免疫共沉淀

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一種以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究?jī)蓚€(gè)蛋白相互作用的經(jīng)典方法。

原理：基于抗體與抗原（靶蛋白）之間的特異性結(jié)合，此時(shí)如果樣品溶液中存在能與靶蛋白相互作用的目的蛋白，會(huì)一同被拉下來(lái)，隨后利用SDS-PAGE，Western Blot等方法對(duì)得到的目標(biāo)蛋白進(jìn)行分析，進(jìn)而證明兩者間的相互作用。

通俗點(diǎn)來(lái)說(shuō)，假設(shè)我們需要研究樣品中A蛋白和B蛋白之間是否存在一些相互作用，首先我們通過(guò)合適的方法處理樣本，將蛋白提取出來(lái)（同時(shí)不能破壞蛋白之間的相互作用），然后用預(yù)先結(jié)合了瓊脂糖珠或者磁珠的A蛋白抗體捕獲樣本中的A蛋白，那么與A蛋白結(jié)合的B蛋白也能一起沉淀下來(lái)。再將蛋白從珠子上裂解下來(lái)，對(duì)B蛋白進(jìn)行檢測(cè)，能檢測(cè)到，說(shuō)明B蛋白在之前的沉淀過(guò)程中隨著A蛋白一起被拉下來(lái)了，進(jìn)而證明二者之間存在相互關(guān)系。

3.免疫熒光共定位

將免疫學(xué)方法（抗原抗體特異結(jié)合）與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來(lái)研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。一般用來(lái)驗(yàn)證2種或3種蛋白是否存在共定位關(guān)系。

由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定位。兩種不同的蛋白使用不同屬性的不同屬性的不同顏色熒光標(biāo)記后，通過(guò)觀察顏色的變化確定是否有共定位，也可以使用軟件分析。

該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問(wèn)題尚未解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。

4.Pull-down實(shí)驗(yàn)

pull-down實(shí)驗(yàn)，又稱拉下實(shí)驗(yàn)，是一種體外親和純化技術(shù)。（這個(gè)實(shí)驗(yàn)跟免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)很像，不同的是免疫共沉淀是在細(xì)胞里進(jìn)行的。）

原理：將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上（如Sepharose）,但細(xì)胞抽提液經(jīng)過(guò)該基質(zhì)時(shí)，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒(méi)有被吸附的“雜質(zhì)"則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過(guò)改變洗脫液或洗脫條件而回收下來(lái)。

為了更有效地利用pull odwn技術(shù)，可以將待純化的蛋白以融合蛋白的形式表達(dá)，即將“誘餌"蛋白與一種易于純化的配體蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘胎-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合標(biāo)簽從細(xì)菌中一步純化出GST融合蛋白。

GST Pull-Down實(shí)驗(yàn)：利用DNA重組技術(shù)將已知蛋白與GST融合，而融合蛋白通過(guò)GST與固化在載體上的GTH（谷胱甘肽）親和結(jié)合。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，我們假定a蛋白和b蛋白可能存在互作，將純化的融合GST的a蛋白和純化的b蛋白以及能特異性結(jié)合GST的Sephrose 4Bbeads混合在一起孵育一定時(shí)間，然后洗去未結(jié)合的蛋白，煮沸beads進(jìn)行SDS-PAGE電泳。通過(guò)Western blot檢測(cè)結(jié)果，我們可以看到GST-a蛋白和b蛋白所對(duì)應(yīng)的條帶，即表明了a蛋白和b蛋白因發(fā)生相互作用而被GST-a pull down(GST對(duì)照只顯示一個(gè)條帶)

pull down技術(shù)可用于驗(yàn)證已知蛋白或胎的相互作用，也可以用來(lái)篩選與已知蛋白或肽互作的未知蛋白或肽。但是在一定程度上不能真實(shí)反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)之間的相互作用，因?yàn)樵隗w外相互作用的蛋白質(zhì)在正常生理?xiàng)l件下不一定會(huì)相互結(jié)合。

5.親和純化質(zhì)譜（AP-MS）

AP-MS（Affinity Purification coupled MS）,即親和純化串聯(lián)質(zhì)譜分析。

原理：基于特異性抗體或其他親和試劑與靶標(biāo)蛋白的親和作用，通過(guò)免疫共沉淀（co-Immunoprecipitation）將靶標(biāo)蛋白與靶標(biāo)蛋白的相互作用蛋白從復(fù)雜的生物體系中純化出來(lái)，進(jìn)而進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)以鑒定靶標(biāo)蛋白的相互作用蛋白。

經(jīng)典的AP-MS實(shí)驗(yàn)通常包含以下4個(gè)關(guān)鍵步驟：1）細(xì)胞或組織的裂解；2）蛋白溶液與偶聯(lián)抗體的親和微珠的孵育；3）非特異性結(jié)合和背景蛋白的清洗以及特異性互作蛋白的洗脫；4）互作蛋白的質(zhì)譜檢測(cè)和分析。

6、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)

雙分子熒光互補(bǔ)（Bimolecular fluorescence complementation, BiFC），該技術(shù)是利用熒光蛋白的特點(diǎn)來(lái)研究蛋白的相互作用。

熒光蛋白可從特定的位點(diǎn)被分開，產(chǎn)生兩個(gè)非熒光活性片段即N端片段（N-fragment）和C端片段（C-fragment）（VN及VC）。當(dāng)兩片段分別被融合到相互作用的蛋白上時(shí)，會(huì)因蛋白的相互作用力而被拉近、發(fā)生互補(bǔ)從而重新構(gòu)建成有活性的熒光蛋白并在激發(fā)光下產(chǎn)生熒光。因此利用熒光顯微鏡就可以直接通過(guò)觀察熒光有無(wú)來(lái)判斷蛋白是否發(fā)生相互作用。

這是在活細(xì)胞中觀察蛋白相互作用的很好的方法。

這個(gè)方法還是存在假陽(yáng)性的，細(xì)胞里大量表達(dá)的分段的黃色熒光蛋白（YFP）可能會(huì)不受研究蛋白的結(jié)合與否而自己結(jié)合在一起，所以陰性對(duì)照的使用非常重要。

7.NanoBiT 蛋白互補(bǔ)技術(shù)