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    克隆形成實驗的原理及實驗步驟

    發(fā)布時間: 2024-03-27  點擊次數(shù): 618次

    一、背景介紹

    克隆形成實驗是研究細(xì)胞存活率并探討單個細(xì)胞增殖潛能的有效方法之一。即在體外培養(yǎng)環(huán)境下,通過使單個細(xì)胞經(jīng)過連續(xù)分裂增殖至少6代,形成的細(xì)胞集群被稱為克隆或集落。每個克隆的尺寸通常在0.3-1.0mm之間,含有50個以上的細(xì)胞。通過計算克隆形成率,能夠?qū)蝹€細(xì)胞的增殖潛力進行量化分析。


    用途:

    (1)評估細(xì)胞增殖能力:克隆形成實驗可以幫助研究人員評估細(xì)胞的增殖潛力。通過觀察和計數(shù)形成的獨立克隆,可以了解細(xì)胞在體外環(huán)境中的增殖速率和能力。


    (2)研究細(xì)胞群體依賴性:克隆形成實驗有助于了解細(xì)胞的群體依賴性,即細(xì)胞是否需要相互合作形成克隆。這對于理解細(xì)胞群體內(nèi)的相互作用和細(xì)胞信號傳導(dǎo)至關(guān)重要。


    (3)篩選藥物和治療方案:克隆形成實驗可用于評估藥物對細(xì)胞增殖的影響。通過在實驗前后比較克隆形成率,研究人員可以評估潛在藥物或治療方案的療效。


    常用的手段有兩個:

    ①平板克隆形成實驗:通過將細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)基中,主要適用于貼壁生長的細(xì)胞,以評估細(xì)胞的克隆形成能力。


    ②軟瓊脂克隆形成實驗:通過將細(xì)胞懸浮于含瓊脂糖的培養(yǎng)基中,主要用于評估貼壁和懸浮的腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的克隆形成潛能。


    二、平板克隆形成實驗的實驗步驟

    (1) 從細(xì)胞處于對數(shù)生長期狀態(tài)開始,通過胰酶消化將細(xì)胞懸浮于血清培養(yǎng)基中,并進行準(zhǔn)確計數(shù);


    (2) 在每個實驗組中,控制細(xì)胞數(shù)量在400-1,000個細(xì)胞/孔的范圍內(nèi)(對于不同的細(xì)胞類型,需要進行預(yù)實驗以確定最佳細(xì)胞數(shù)量),并接種于6孔板;


    (3) 持續(xù)培養(yǎng)至14天,或直到大多數(shù)單個克隆中的細(xì)胞數(shù)超過50個。在培養(yǎng)過程中,每隔3天更換培養(yǎng)基,并觀察細(xì)胞狀態(tài);


    (4) 克隆形成完成后,使用1 mL 4%多聚甲醛進行細(xì)胞固定,固定時間為15-30分鐘。最后,用PBS洗滌;


    (5) 向每個孔中加入1 mL結(jié)晶紫染液,染色時間控制在10-20分鐘內(nèi);


    (6) 利用PBS進行多次細(xì)胞洗滌,進行拍照(分別對整個六孔板及每個孔進行單獨拍照)。


    注意:本實驗的成功關(guān)鍵在于細(xì)胞懸液的制備和適度的接種密度,務(wù)必確保細(xì)胞均勻分散,防止細(xì)胞團的形成,并謹(jǐn)慎確保接種密度不過于密集。

    圖片

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