要做好CCK-8實(shí)驗(yàn)，這三個(gè)重要環(huán)節(jié)請(qǐng)注意

在做細(xì)胞基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必要的一步就是需要探究清楚細(xì)胞的增殖變化和毒性耐藥變化情況，為下一步實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

我們?cè)谧鯟CK-8增殖和毒性實(shí)驗(yàn)中常常會(huì)遇到一下幾個(gè)問(wèn)題：

1.細(xì)胞鋪板問(wèn)題 2.給CCK-8的方式問(wèn)題 3.CCK-8的反應(yīng)時(shí)間問(wèn)題

首先，在進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)， 需要用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，得到細(xì)胞數(shù)量后按照所需鋪板的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行調(diào)整。一般96孔板鋪板數(shù)量為1*10^6/孔。

制備細(xì)胞懸液時(shí)需要反復(fù)吹打，使細(xì)胞懸液充分混勻，降低出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)塊的幾率。一般96孔板，每孔加入100微升細(xì)胞懸液，從孔的9點(diǎn)鐘方向打入，加入半張板子時(shí)，需要再次將細(xì)胞吹勻，然后繼續(xù)加剩余的孔。

待全部加入完畢時(shí)，蓋上蓋子，放入培養(yǎng)箱。（細(xì)胞的均勻鋪被是本實(shí)驗(yàn)成功的大前提）。

其次，是細(xì)胞的處理。一般給CCK-8有兩種方式：第一種是直接每孔加入10微升的CCK8原液；另一種則是配置含10%的CCK-8培養(yǎng)基，以換液的形式加入孔板。

第一種方式的弊端在于10微升的CCK-8量比較少，可能因沾在孔壁導(dǎo)致誤差的出現(xiàn)。

第二種方式可以避免上述情況的發(fā)生，但操作過(guò)程中仍需注意10%的CCK-8培養(yǎng)基需要現(xiàn)配現(xiàn)用；其次打入100微升的CCK-8時(shí)沿著孔壁將槍頭伸入液體緩緩打出，再移出槍頭。

期間可能會(huì)產(chǎn)生小氣泡，需要用無(wú)菌針頭燒紅插入氣泡，消除氣泡。（氣泡會(huì)影響OD值，因此應(yīng)該盡量消除）。

最后，就是反應(yīng)時(shí)間問(wèn)題。將孔板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-4小時(shí)，引細(xì)胞種類和數(shù)量的差異，可能形成的Formazan的量不一樣。因此需要把握好培養(yǎng)的時(shí)間。

我的經(jīng)驗(yàn)是：在培養(yǎng)2h后，取出孔板，每孔抽取90微升加入至新孔板，進(jìn)行第一次檢測(cè)，看看顯色的深淺程度（仍然需要注意氣泡，若有氣泡需要待氣泡消除后再進(jìn)行檢測(cè)）

若顯色較淺，則可除去舊培養(yǎng)基，加入新培養(yǎng)基，再培養(yǎng)1-4小時(shí)，重新加CCK-8步驟，然后將其放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時(shí)，再進(jìn)行檢測(cè)（其最佳反應(yīng)時(shí)間為0.5、1、2小時(shí)）

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