流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題分析

流式細(xì)胞技術(shù)（Flow Cytometry,簡(jiǎn)稱FCM）是一種高效的方法，用于分析和收集細(xì)胞懸液中的單個(gè)細(xì)胞。FCM的優(yōu)勢(shì)在于其速度快、結(jié)果客觀，并且具有重要的統(tǒng)計(jì)意義。它能夠處理復(fù)雜的樣本，同時(shí)收集多個(gè)參數(shù)，其可靠性和重復(fù)性都非常出色。

今天我將總結(jié)并分享一系列關(guān)于流式細(xì)胞技術(shù)的常見(jiàn)問(wèn)題及其分析。對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)的原理和步驟不甚清晰的同學(xué)，建議先閱讀本公眾號(hào)以往的文章，了解背景知識(shí)。

1.熒光抗體染色無(wú)信號(hào)或信號(hào)弱

（1）加入的抗體量不足：這是普通的一種情況，只需要摸索實(shí)驗(yàn)條件，適當(dāng)增加抗體的量或濃度。

（2）細(xì)胞數(shù)量過(guò)多：熒光弱可能是因?yàn)榧?xì)胞相對(duì)于染料太多了，應(yīng)該正確地調(diào)整細(xì)胞的密度，一般低于1*10^7個(gè)/ml。

（3）抗體儲(chǔ)存方式不對(duì)：抗體沒(méi)有保存在4℃并且避光，比如冷凍（-20℃甚至更低）保存可能會(huì)導(dǎo)致熒光抗體的沉降，顯著影響抗體染色效果。

（4）用于細(xì)胞內(nèi)染色的熒光染料分子量太大：染料體積太大，因此其進(jìn)入細(xì)胞的可能性降低。

（5）一抗和二抗不相容：使用的二抗應(yīng)與一抗的物種來(lái)源相同（例如，一抗為兔源，則應(yīng)該使用抗兔源二抗）。

（6）儀器問(wèn)題：（流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)由三個(gè)部分組成：激光器、濾光片和檢測(cè)器。激光器的數(shù)量、檢測(cè)器的數(shù)量以及濾光器的類型共同決定儀器的檢測(cè)范圍）。這三部分之一出現(xiàn)問(wèn)題的時(shí)候，就無(wú)法檢測(cè)到熒光信號(hào)。

如濾光片選擇有誤：不同熒光有不同的發(fā)射譜，為了檢測(cè)到信號(hào)，需要搭配能夠捕捉到該波長(zhǎng)信號(hào)的濾光片（濾光片可以將熒光激發(fā)后產(chǎn)生的相應(yīng)波長(zhǎng)的光子引導(dǎo)至特定的傳感器上）；激光器沒(méi)有對(duì)齊：必要時(shí)通過(guò)運(yùn)行液流檢查微珠來(lái)調(diào)整路線。

（7）靶蛋白不存在/表達(dá)水平低：巧婦難為無(wú)米之炊，要給靶蛋白染色，至少要確保組織/細(xì)胞類型表達(dá)的靶蛋白至少處于足夠檢測(cè)的量。

（8）靶蛋白存在于細(xì)胞表面還是細(xì)胞內(nèi)：有些抗原表達(dá)在細(xì)胞表面，有些表達(dá)在胞漿、細(xì)胞器內(nèi)、胞核，甚至有些在所有部位都表達(dá)。比如對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行染色時(shí)，胰蛋白酶通?？梢砸鸺?xì)胞表面蛋白的內(nèi)化，因此需要確定好抗原的表達(dá)位置，選擇合適的染色方法。

（9）靶蛋白的表達(dá)需要經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)：有些抗原在活化后發(fā)生下調(diào)，而有些蛋白則需要被誘導(dǎo)才能表達(dá)。因此要選擇合適的方法激活細(xì)胞，使其充分表達(dá)靶蛋白，同時(shí)要加蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑使其留在胞內(nèi)，然后固定破膜，染相應(yīng)抗體。

（10）靶蛋白是分泌蛋白：分泌蛋白的檢測(cè)十分困難，因?yàn)榈鞍讜?huì)在檢測(cè)前從細(xì)胞中釋放出來(lái)且可能快速降解。高爾基體阻斷劑（如布雷非德菌素A）可用于抑制表達(dá)蛋白的分泌，使其仍保留在高爾基體中。然后再用細(xì)胞內(nèi)染色法檢測(cè)靶標(biāo)蛋白。

（11）補(bǔ)償過(guò)高：使用陽(yáng)性對(duì)照再次正確設(shè)置流式細(xì)胞儀

2.熒光強(qiáng)度過(guò)高

（1）抗體濃度過(guò)高：這將會(huì)導(dǎo)致非常明顯的非特異性結(jié)合或者是特異性結(jié)合的高強(qiáng)度熒光。

（2）過(guò)多抗體被捕獲于細(xì)胞內(nèi)：在胞內(nèi)染色的時(shí)候，較大的熒光分子被困在細(xì)胞內(nèi)部。

（3）封閉不足：封閉這個(gè)操作可以有效地減少染料和蛋白的非特異性結(jié)合。

3.在應(yīng)該只有一個(gè)細(xì)胞群的情況下觀察到多個(gè)細(xì)胞群

（1）樣品本身含有多個(gè)表達(dá)靶蛋白的細(xì)胞群：有可能是因?yàn)楸磉_(dá)該靶蛋白的細(xì)胞群不止一個(gè)，但操作過(guò)程中沒(méi)有做好分離。

（2）出現(xiàn)細(xì)胞雙峰：出現(xiàn)了第一群兩倍熒光強(qiáng)度的第二群細(xì)胞?？赡苁羌?xì)胞分離不充分甚至是細(xì)胞團(tuán)塊沒(méi)有過(guò)濾掉，導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)多個(gè)細(xì)胞聚集在一起。

4.儀器檢測(cè)到的粒子太少

(這里的粒子指的是上樣時(shí)儀器檢測(cè)到的微粒，有可能是細(xì)胞，也有可能是破碎細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞器，或者沒(méi)有充分分離而形成的細(xì)胞團(tuán)塊）

（1）細(xì)胞密度低：即每毫升樣品的細(xì)胞數(shù)目太少，自然檢測(cè)的效率就不高。

（2）檢測(cè)的參數(shù)當(dāng)中電壓設(shè)置得太低。

（3）細(xì)胞聚集，堵塞管道：多個(gè)細(xì)胞聚集成團(tuán)快，卻被檢測(cè)成一個(gè)粒子，且該粒子大小是異常的，在后續(xù)圈門也有可能被廢棄。染色前要輕輕吹打幾次，確保形成單細(xì)胞懸液，上樣之前最好再次混勻。另外，染細(xì)胞死活對(duì)于這一問(wèn)題也有幫助，因?yàn)樗兰?xì)胞會(huì)釋放它的DNA，而DNA非常粘稠，最后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞成團(tuán)。

5.背景高或陽(yáng)性細(xì)胞百分比高

（1）抗體過(guò)量。

（2）補(bǔ)償過(guò)低：流式細(xì)胞分析中經(jīng)常要用到2種以上的熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行染色，而目前所使用的多種熒光染料發(fā)射譜間有一定重疊，也就是說(shuō)，熒光A的激發(fā)光會(huì)有一部分被熒光B的通道檢測(cè)到，這就是熒光溢漏。例如，當(dāng)我們?cè)谶M(jìn)行單色流式實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，可以在其他通道砍到熒光信號(hào)，這些熒光信號(hào)就是溢漏出來(lái)的熒光，而糾正熒光溢漏的過(guò)程就是“補(bǔ)償"。補(bǔ)償太低，就無(wú)法正確地糾正這些溢漏的熒光信號(hào)，使背景變高。

6.側(cè)向散射（反映細(xì)胞的顆粒度）背景高

（1）細(xì)胞裂解過(guò)度：制備樣品時(shí)離心或振蕩過(guò)度，使細(xì)胞破碎產(chǎn)生細(xì)胞碎片。

（2）細(xì)菌污染：從其它微小顆粒和背景信號(hào)中區(qū)分細(xì)菌群落的方法是用熒光染料標(biāo)記細(xì)菌，然后使用該熒光來(lái)識(shí)別目標(biāo)群落。

（3）死細(xì)胞的處理：流式細(xì)胞術(shù)非常容易被死細(xì)胞干擾，因?yàn)樗兰?xì)胞比活細(xì)胞更容易攝取抗體和探針，導(dǎo)致明顯的非特異性染色。且死細(xì)胞的自發(fā)熒光往往特別強(qiáng)，這樣背景熒光變強(qiáng)，就無(wú)法觀察到一些靶蛋白的弱陽(yáng)性表達(dá)了。

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