瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)

一、瓊脂糖凝膠的特點(diǎn)

核酸分子是兩性解離分子，在高于其等電點(diǎn)的電泳緩沖液中，其堿基不解離，而磷酸基團(tuán)全部解離，核酸分子因而帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極遷移。

瓊脂糖主要從海洋植物瓊脂中提取而來(lái)并經(jīng)糖基化修飾，為一種聚合鏈線性分子，使用瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質(zhì)，發(fā)揮分子篩功能，使得大小和構(gòu)象不同的核酸分子的遷移率出現(xiàn)較大差異，從而達(dá)到分離的目的。

因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳，其優(yōu)點(diǎn)如下。

（1）瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。

（2）瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大（約占98%-99%），近似自由電泳，樣品擴(kuò)散較自由電流，對(duì)樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分析率高，重復(fù)性好。

（3）瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收，電泳過(guò)程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測(cè)及定量測(cè)定。

（4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測(cè)定。制成干膜可長(zhǎng)期保持。

二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳對(duì)核酸的分離作用主要是依據(jù)它們的相對(duì)分子量質(zhì)量及分子構(gòu)型，同時(shí)與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。

1.核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系

（1）DNA分子在凝膠中，DNA 片段遷移距離（遷移率）與堿基對(duì)的對(duì)數(shù)成反比，因此通過(guò)已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動(dòng)的距離與未知片段的移動(dòng)距離時(shí)行比較，便可測(cè)出未知片段的大小。

（2）瓊脂脂糖的濃度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。

瓊脂糖濃度與DNA分離范圍：

2.核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系

不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋汗﹥r(jià)閉環(huán)DNA（covalently closed circular，cccDNA）＞直線DNA＞開(kāi)環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA

當(dāng)瓊脂糖濃度太高時(shí)，環(huán)狀DNA不能進(jìn)入膠中，相對(duì)遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性狀棒）則可以長(zhǎng)軸方向前進(jìn)（Rm>0），由此可見(jiàn)，這三種構(gòu)型的相對(duì)遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時(shí)，也受到電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度等的影響。

三、瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)方法

1、選擇適合樣品預(yù)期片段大小的瓊脂糖凝膠濃度百分比。將瓊脂糖粉末與用于運(yùn)行凝膠的相同類(lèi)型的緩沖液（TAE）結(jié)合起來(lái)，加熱使混合物融化，避免沸騰。

2、選擇所需尺寸的凝膠澆注模具和梳子，為樣品和marker提供足夠數(shù)量的孔，以及容納每個(gè)待裝樣品數(shù)量的孔容量。

3、膠凝固后，將凝膠放入電泳儀中，電泳液沒(méi)過(guò)凝膠，根據(jù)加入量的多少，決定混合多少u(mài)l的loding buffer,將樣液混合loding buffer用移液槍加入到凝膠中。

4、蓋上蓋子，確保電極和蓋子的方向正確，注意正負(fù)極，打開(kāi)電泳儀，設(shè)定凝膠運(yùn)行的時(shí)間和電壓，根據(jù)樣品大小確定運(yùn)行時(shí)間。

四、瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)技巧和注意事項(xiàng)

1、瓊脂糖凝膠溶液配制時(shí)總液體量不宜超過(guò)錐型瓶50%容量。

2、加熱時(shí)可以中途搖動(dòng)搖動(dòng)，防止瓊脂糖凝膠凝在錐形瓶底部。

3、注意不要損傷梳底部的凝膠。防止加樣時(shí)樣品漏出。

4、凝膠濃度越低，分辨的片段越大；凝膠濃度約高，分辨的片段越小；

5、使用紫外投射儀觀察，紫外光對(duì)DNA分子有損傷作用，不可長(zhǎng)時(shí)間照射。從膠上回收DNA時(shí)，應(yīng)盡量縮短光照時(shí)間以減少紫外光切割DNA。

6、紫外燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)鏡，以免損傷眼睛。