慢病毒制備和導(dǎo)入細(xì)胞的操作步驟及注意事項(xiàng)

前置知識(shí)

通過(guò)病毒介導(dǎo)將核酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞是一種常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，被廣泛用于基因傳遞、基因表達(dá)和功能研究等領(lǐng)域。這個(gè)實(shí)驗(yàn)通常分為以下6個(gè)部分：

1.選擇適當(dāng)?shù)牟《据d體：常用的病毒載體包括腺病毒（Adenovirus）、腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）和逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）。

2. 構(gòu)建表達(dá)載體：將目標(biāo)核酸（例如基因、RNA等）插入到病毒載體的適當(dāng)位點(diǎn)上，構(gòu)建表達(dá)載體。這通常涉及將目標(biāo)核酸序列克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體質(zhì)粒中，并進(jìn)行驗(yàn)證和測(cè)序。

3. 病毒包裝和擴(kuò)增：將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到特定的包裝細(xì)胞中，這些細(xì)胞能夠產(chǎn)生具有完整病毒基因組的病毒顆粒。病毒顆?？梢酝ㄟ^(guò)細(xì)胞培養(yǎng)和病毒擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。

4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將目標(biāo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，然后將病毒顆粒加入培養(yǎng)基中與細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。病毒顆粒會(huì)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。

5.核酸導(dǎo)入和表達(dá)：一旦病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，它會(huì)釋放出核酸負(fù)鏈，該負(fù)鏈會(huì)被細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制利用。目標(biāo)核酸的表達(dá)產(chǎn)物（例如蛋白質(zhì)）會(huì)在細(xì)胞內(nèi)合成，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要發(fā)揮其功能。

6.實(shí)驗(yàn)分析：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，可以?duì)細(xì)胞和表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的分析。這可能包括檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平、功能研究、細(xì)胞行為觀察等。

操作步驟

A 慢病毒制備：

1、提前一周復(fù)蘇293T細(xì)胞，使用10% FBS-DMEM培養(yǎng)基傳代3次以上。

轉(zhuǎn)染前一天將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞用0.25%胰酶消化，得到細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，然后進(jìn)行慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，稀釋到10個(gè)/mL；

將293T接種到6孔板（每孔接種2 mL），使其密度為40%。

待其生長(zhǎng)到孔板面積80-90%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2、通過(guò)質(zhì)粒大提獲得無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒。

3、在1.5mLEP管中分別加入150μL DMEM培養(yǎng)基、15μL lipofectamine 2000。

4、在1.5 mL EP 管中分別加入700μL DMEM培養(yǎng)基、7μg目的DNA、5.25μg的psPAX2、1.75μg的pCMV-VSVG（使三條質(zhì)粒質(zhì)量比為 4:3:1）。

5、將等體積的質(zhì)粒混合物加入到轉(zhuǎn)染試劑混合物中，室溫靜置5min。

6、將隔夜培養(yǎng)的6孔板中培養(yǎng)基小心吸出，替換為新鮮DMEM（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基。每個(gè)孔中加入300 μL的DNA-lipo 2000復(fù)合物。

7、分別在轉(zhuǎn)染后24h、48h，收集六孔板中病毒上清液，經(jīng)0.45μm的濾膜過(guò)濾或離心去除細(xì)胞碎片（短期內(nèi)可放于4℃保存，長(zhǎng)期保存于-80℃冰箱，勿反復(fù)凍融）。

B 慢病毒感染：

1、提前一周復(fù)蘇靶細(xì)胞，傳代三次以上保證細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。病毒感染前一天將靶細(xì)胞傳代到6孔板，使細(xì)胞生長(zhǎng)密度為約20%。

2、待細(xì)胞生長(zhǎng)至孔板面積50-60%時(shí)，加入2ml病毒液，加入polybrene,并補(bǔ)加0.5ml（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)24h。

3、用（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基更換病毒液，恒溫培養(yǎng)24h。

4、加入適量的抗生素篩選，每次換液時(shí)補(bǔ)加抗生素，至靶細(xì)胞細(xì)胞無(wú)明顯死亡。

注意事項(xiàng)：

1.選擇合適的載體和元件：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體和啟動(dòng)子，例如CMV啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子等。

2. 細(xì)胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染密度：細(xì)胞狀態(tài)好，且處于指數(shù)生長(zhǎng)階段。靶細(xì)胞密度不宜過(guò)高或過(guò)低，建議將細(xì)胞密度控制在指數(shù)期的70-80%；

3. 選擇合適轉(zhuǎn)染試劑、比例和轉(zhuǎn)染時(shí)間：選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑，不同類(lèi)型的細(xì)胞和外源DNA可能需要使用不同的試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染；

同時(shí)，還需要對(duì)慢病毒質(zhì)粒、DNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化?？稍诟腥景屑?xì)胞時(shí)加入適量的聚凝胺提高轉(zhuǎn)染效率。

4.抗生素濃度：可在轉(zhuǎn)染前做MTT實(shí)驗(yàn)探究其工作濃度，選取合適的篩選濃度使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠存活并形成穩(wěn)定的細(xì)胞系。

5.篩選時(shí)間：在進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要進(jìn)行足夠長(zhǎng)的篩選時(shí)間以檢測(cè)出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染后可通過(guò)WB，流式細(xì)胞術(shù)，Dot blot等方法驗(yàn)證。

6．對(duì)照組設(shè)置：設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照以評(píng)估轉(zhuǎn)染效果和篩選是否成功。

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