細胞轉(zhuǎn)染操作方法及各方法比較

轉(zhuǎn)染 ，是將外源性基因?qū)爰毎麅?nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因?qū)爰毎姆独?化學(xué)介導(dǎo)方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的 技術(shù)；生物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。理想細胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率高的方法，同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是，病毒轉(zhuǎn)染方法的準備程序復(fù)雜，常常對細胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點。 需要指出的一點，無論采用哪種轉(zhuǎn)染技術(shù)，要獲得*的轉(zhuǎn)染結(jié)果，可能都需要對轉(zhuǎn)染條件 進行優(yōu)化。影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多，從細胞類型、細胞培養(yǎng)條件和細胞生長狀態(tài)，到轉(zhuǎn)染 方法的操作細節(jié)，都需要考慮。 

一、細胞傳代 

1. 試驗準備：200ul/1mlTip 頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養(yǎng)皿，離心管。 

2. 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用 1ml 的 PBS 溶液洗滌兩次。 

3. 用 Tip 頭加入 1ml Trypsin 液，消化 1 分鐘(37℃，5%CO2 )。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細胞*從壁上脫落下來為止。 

4. 加入 1ml 的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。 

5. 用 Tip 頭多次吹吸，使細胞*分散開。

6. 將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm 離心 5min。 

7. 用培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后選擇 0.8X106 個細胞加入一個 35mm 培養(yǎng)皿。 

8. 將合適體積*培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。 

9. 將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。 

二、細胞轉(zhuǎn)染 

1. 轉(zhuǎn)染試劑的準備 

① 將 400ul 去核酸酶水加入管中，震蕩 10 秒鐘，溶解脂狀物。 

② 震蕩后將試劑放在－20 攝氏度保存，使用前還需震蕩。 

2. 選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA 質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的 MyoD 或者 EGFP 的 DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。 

3. 將混合液在室溫放置 10―15 分鐘。 

4. 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用 PBS 或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。 

5. 加入混合液，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。 

6. 到時后，根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液，之后加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 24－48 小 時。 

三、第二次細胞傳代 

1. 在轉(zhuǎn)染后 24 小時，觀察實驗結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。 

2. 再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度 0.8X105個細胞/35mm 培養(yǎng)皿將細胞重 新轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中。 

3. 在正常條件下培養(yǎng) 24 小時后按照染色要求條件固定。

四、各種轉(zhuǎn)染方法比較

1、DEAE－葡聚糖法：其原理是帶正電的 DEAE-葡聚糖與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細胞內(nèi)吞。主要應(yīng)用于瞬時轉(zhuǎn)染。特點是相對簡便、重復(fù)比磷酸鈣好，但對細胞有一定的毒副作用，轉(zhuǎn)染時需除血清且一般只用于 BSC-1，CV-1， COS 細胞系。

2、磷酸鈣法：其原理是磷酸鈣 DNA 復(fù)合物吸附細胞膜被細胞內(nèi)吞。主要應(yīng)用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、染瞬轉(zhuǎn)染。特點是不適用于原代細胞（所需的 DNA 濃度較高），操作簡便但重復(fù)性差，有些細胞不適用細胞建議用 CSCL 梯度離心，轉(zhuǎn)染是拷貝數(shù)較多。

3、陽離子脂質(zhì)體法：其原理是帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負電的磷酸基團形成復(fù)合物，然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細胞膜上的唾液酸殘基的負電核結(jié)合；另一種解釋是通過細胞是內(nèi)吞作用而被進入細胞。(若 DNA 濃度過高，中和脂質(zhì)體表面電核，而降低了與細胞的結(jié)合能力)。主要應(yīng)用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、瞬時轉(zhuǎn)染、 所有細胞。特點是使用方法簡單，可攜帶大片段 DNA，通用于各種類型的裸露 DNA 或 RNA，能轉(zhuǎn)染各種類型的細胞， 沒有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率，但在體內(nèi)，能被血清清除，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強烈的抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致高水平的毒性，這在很大程度上限制了其應(yīng)用。

4、陽離子聚合物：其原理是帶正電的聚合物與核酸帶負電的磷酸基團形成帶正電的復(fù)合物后與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過內(nèi)吞作用進入細胞。主要應(yīng)用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、瞬時轉(zhuǎn)染、 所有細胞。特點是除了具有陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率高，操作簡單，適用范圍廣，重復(fù)性好等特點外，還具有在體內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，細胞毒性低等特點，是新一代的轉(zhuǎn)染試劑。

5、逆轉(zhuǎn)錄病毒 (RNA)：其原理是通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用而進入宿主細胞，之后反轉(zhuǎn)入酶啟 動合成 DNA 并隨機整合到宿主基因組中。主要應(yīng)用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、特定宿主細胞。特點是可用于難轉(zhuǎn)染的細胞、原代細胞， 體內(nèi)細胞等，但攜帶基因不能太大 （<8kb），細胞需處分裂期，需考慮安全因素。

6、腺病毒(雙鏈 DNA)：其原理是先和細胞表面的受體結(jié)合，繼而在 αv 整合素介導(dǎo)下被細胞內(nèi)吞。主要應(yīng)用于瞬時轉(zhuǎn)染、特定宿主細胞。特點是可用于難轉(zhuǎn)染的細胞，需考慮安全因素。

7、Biolistic  顆粒傳遞法 （基因槍粒子轟擊法）：其原理是將 DNA 用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道 裝置投射入細胞，DNA 在胞內(nèi)逐步釋放，表達。主要應(yīng)用于瞬時性轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。特點是可用于人的表皮細胞，纖維原細胞，淋巴細胞系以及原代細胞。

8、顯微注射法：其原理是用顯微操作將 DNA 直接注入靶細胞核。主要應(yīng)用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、瞬時轉(zhuǎn)染。特點是轉(zhuǎn)染細胞數(shù)有限，多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動物的胚胎細胞。

9、電穿孔法：其原理是高脈沖電壓破壞細胞膜電位， DNA 通過膜上形成的小孔導(dǎo)入。主要應(yīng)用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、瞬時轉(zhuǎn)染、所有細胞。特點是適用性廣，除了質(zhì)粒外，還可轉(zhuǎn)染大的基因組（>65kb）但細胞致死率高，DNA 和細胞用量大， 需根據(jù)不同細胞類型優(yōu)化電穿孔實驗條件，拷貝數(shù)較少 1-20。