細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)小事——貼壁細(xì)胞的消化方法

如何消化讓細(xì)胞生長(zhǎng)的更好，養(yǎng)細(xì)胞關(guān)鍵還是在消化，以下介紹幾種細(xì)胞的消化方法

一、酶消化法

1、胰酶，這是用得最多的。一般濃度在0.25-0.5%。消化的時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)、操作手法，溫度等因素而變化，從幾分鐘到幾十分鐘不等。0.25%的胰酶，37℃一般在消化單層貼壁的細(xì)胞一般1-5分鐘就足夠了，用血清或者含血清的*培養(yǎng)基終止。

2、膠原酶，一般用于原代細(xì)胞消化，這種方法作用溫和，對(duì)細(xì)胞損傷較小，消化的時(shí)間也略長(zhǎng)，不推薦的原因是膠原酶有點(diǎn)小貴而且培養(yǎng)細(xì)胞株感覺(jué)沒(méi)有多大的必要。

二、離子螯合劑

不破壞細(xì)胞表面分子，僅與CAMs螯合，因此，如果檢測(cè)細(xì)胞表面分子的話，盡量，甚至是一定不要用酶消化法。

1、EDTA，一般濃度在0.02%左右，使用它來(lái)消化細(xì)胞時(shí)，注意它能顯著影響pH值，而且在弱堿性條件下才易溶，而且它不能被終和，因此，消化下來(lái)的細(xì)胞一定要洗一遍。

三、物理法

直接吹打或用細(xì)胞刮刀，貼壁很牢的細(xì)胞可以使用這個(gè)方法，吹打和刮刀都會(huì)給細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷，建議不到萬(wàn)不得已不要使用此法。

四、冷凍法

采用細(xì)胞冷凍后收縮的原理，從而使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上脫落。優(yōu)點(diǎn)：對(duì)細(xì)胞損傷小，不需要中止或洗細(xì)胞，方便，不需要另外配制消化液。特別適用那些貼壁不是特別緊，又特別嬌氣的細(xì)胞。缺點(diǎn)：細(xì)胞常成小片脫落，重新鋪板后細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)有點(diǎn)聚團(tuán)。常用于間充質(zhì)干細(xì)胞、DC細(xì)胞的消化，具體過(guò)程是：1、用較多的4℃的PBS洗滌一遍細(xì)胞，再加入適量的 4℃的PBS，靜置操作臺(tái)上，很快細(xì)胞受冷皺縮小片脫落，3、輕輕吹打，細(xì)胞即*脫落，4、按一定比例傳代。

細(xì)胞消化難題：

1，成團(tuán)、絮狀：

消化液里加入edta可以減少細(xì)胞成團(tuán)的現(xiàn)象，血清可以終止胰酶的作用，越好的血清使用的效價(jià)更高，用胰酶消化后加血清終止，如果消化液中加入了edta的話，就要將消化液倒干凈，如果細(xì)胞貼壁要求不是很?chē)?yán)格的話，一般不需要進(jìn)行離心。

比如說(shuō)4T1細(xì)胞，這種細(xì)胞的貼壁能力天生很強(qiáng)，用0.5%胰酶(含0.1%EDTA)一般要消化10~12min。用PBS洗滌時(shí)要洗凈殘余的培養(yǎng)基，加入胰酶后在培養(yǎng)箱中消化(避免細(xì)胞室溫下受損以及在此溫度時(shí)胰酶活性*)至細(xì)胞收縮變圓(可顯微鏡下觀察)且有少許細(xì)胞脫落(呈流沙狀)，隨后立即棄去胰酶(如果脫落的細(xì)胞很多且需要大量細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，則不能棄去胰酶)，加入培養(yǎng)基輕輕彈散(不能用無(wú)血清培養(yǎng)基或者PBS替代，否則細(xì)胞聚集成團(tuán)塊或絮狀)。

也可以用2%利多卡因消化5-8分鐘，然后再棄去。

消化過(guò)度怎么辦？

馬上用培養(yǎng)基中和，收集全部的細(xì)胞到無(wú)菌的離心管中800RPM 3分鐘。棄上清，用全培重懸，換新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，狀態(tài)不好的細(xì)胞在培養(yǎng)的過(guò)程中會(huì)死亡脫落，在換液的時(shí)候可以清除掉。