細(xì)胞傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)常見問題詳解

收到細(xì)胞先不開蓋,用酒精將整個(gè)細(xì)胞瓶外壁進(jìn)行消毒，放在培養(yǎng)箱靜置若干小時(shí)后(看細(xì)胞密度而定)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照(建議收細(xì)胞時(shí)的培養(yǎng)基拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，顯微鏡下拍細(xì)胞100X，200X各兩張)，排除細(xì)胞本身污染的情況。

視細(xì)胞生長密度而定，常規(guī)細(xì)胞2-3天更換培養(yǎng)基。

一般情況下細(xì)胞生長至*匯合后就應(yīng)該傳代，所有細(xì)胞生長都有一個(gè)要求不宜生長過密(也就是常說的長老了)，但有接觸抑制的細(xì)胞，在匯合前就必須進(jìn)行傳代，這類細(xì)胞一般在密度70-80%就進(jìn)行傳代，否則會(huì)引起細(xì)胞分化。

去掉原T25培養(yǎng)瓶里面的培養(yǎng)基，T25瓶加3-4 ml PBS洗1-2次;棄PBS，再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙明顯，部分細(xì)胞剛開始脫離瓶壁，加4 ml左右*培養(yǎng)液混勻終止消化，將細(xì)胞小心吹打下來，1000 rpm/min室溫離心5min;棄上清，細(xì)胞沉淀用*培養(yǎng)液重懸，按要求分瓶(視細(xì)胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6，1:6-1:8)，每T25瓶補(bǔ)足培養(yǎng)基至5-6 ml，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時(shí)，將細(xì)胞懸液移入離心管中，1000 rpm/min 室溫離心5 min。棄上清，細(xì)胞沉淀用*培養(yǎng)液重懸，按要求分瓶(視細(xì)胞密度而定1:4-1:8)，每T25瓶加*培養(yǎng)液至4-5 ml，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。有些懸浮細(xì)胞趨于成團(tuán)生長，此時(shí)細(xì)胞生長狀態(tài)良好，當(dāng)補(bǔ)液時(shí)，需避免反復(fù)吹打。

一般使用trypsin-EDTA濃度為0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液濃度過高時(shí)，易造成培養(yǎng)基中細(xì)胞碎片增多，黑渣子增多，常規(guī)細(xì)胞傳代時(shí)建議用0.05%的胰酶進(jìn)行消化，對(duì)于難消化的細(xì)胞可采用0.25%胰酶進(jìn)行消化，細(xì)胞密度過高超過80%時(shí)，采用分步消化法。胰酶儲(chǔ)存在–20°C，解凍在4°C進(jìn)行，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機(jī)會(huì)。

胰酶消化的程度是細(xì)胞培養(yǎng)中的一個(gè)關(guān)鍵步驟：消化過度細(xì)胞碎片增多，黑渣子增多，細(xì)胞會(huì)成片脫落，嚴(yán)重影響細(xì)胞活性，并有部分細(xì)胞漂浮，隨棄去的胰酶流失;消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性。

不同細(xì)胞對(duì)消化液的敏感性不同，胰酶消化的時(shí)間也會(huì)有差異。胰酶消化時(shí)間與胰酶的濃度，是否含EDTA，胰酶的儲(chǔ)存時(shí)間，胰酶的儲(chǔ)存溫度，是否反復(fù)凍融，消化加入的胰酶體積，消化溫度及細(xì)胞的密度有關(guān)。消化對(duì)于新購買的細(xì)胞，建議客戶先用低濃度的胰酶仔細(xì)去摸索一下消化時(shí)間，可每隔1分鐘鏡下觀察細(xì)胞是否變圓，記錄最佳消化時(shí)間，下一次操作參考之前的記錄來控制時(shí)間即可。

細(xì)胞傳代或凍存時(shí)欲回收細(xì)胞，其離心速度一般為800-1000 rpm/min，室溫離心5-8分鐘，轉(zhuǎn)速過高，將造成細(xì)胞破裂死亡。

顯微鏡下觀察：活細(xì)胞中間透亮，飽滿，有光澤，死細(xì)胞較暗。也可以通過臺(tái)盼藍(lán)染色來計(jì)算細(xì)胞活力。

用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200～2000 個(gè)/毫升，在0.1 毫升的細(xì)胞懸液中加入0.1 毫升的0.4%的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞?；罴?xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞，注意計(jì)數(shù)需在加入臺(tái)盼藍(lán)10min內(nèi)完成。有細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的，可直接用計(jì)數(shù)儀進(jìn)行。

EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，易造成細(xì)胞狀態(tài)不好，最終造成細(xì)胞無法存活。

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無法存活。

細(xì)胞傳代后放入培養(yǎng)箱沒有搖勻，或者放入時(shí)搖勻，但在細(xì)胞貼壁前，又移動(dòng)了培養(yǎng)瓶，頻繁開關(guān)培養(yǎng)箱引起的振動(dòng)或者培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液過少，培養(yǎng)箱擱板表面不平整，這些因素會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長不均勻。

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。運(yùn)輸過程對(duì)細(xì)胞有嚴(yán)重影響。解凍過程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80°C太久。

一些懸浮細(xì)胞抱團(tuán)生長是正?，F(xiàn)象，大部分懸浮細(xì)胞在細(xì)胞密度很高的情況下，很可能會(huì)出現(xiàn)部分細(xì)胞抱團(tuán)生長的現(xiàn)象，聚團(tuán)細(xì)胞很容易死亡并演化成絮狀物，殃及周圍的懸浮細(xì)胞，因此在培養(yǎng)懸浮細(xì)胞時(shí)需控制好細(xì)胞密度。如果出現(xiàn)了細(xì)胞團(tuán)，可以通過細(xì)胞篩去掉部分較大的細(xì)胞團(tuán)，也可以嘗試一下方法：將細(xì)胞懸液收集到15 ml離心管中，靜置20 min左右，小心取上層細(xì)胞上清培養(yǎng)(該方法只能去除部分較大的細(xì)胞團(tuán))。

部分細(xì)胞本身存在一定的空泡(如HepG2，Ishikawa及一些耐藥株等)，這個(gè)是正?，F(xiàn)象。如果只有少數(shù)細(xì)胞有內(nèi)出現(xiàn)極少空泡，則很可能是細(xì)胞狀態(tài)不佳，可以通過調(diào)整血清濃度，控制消化，控制傳代比例及時(shí)間等方法來調(diào)整細(xì)胞狀態(tài);如果大部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡，且單個(gè)細(xì)胞內(nèi)空泡數(shù)目偏多，則可能細(xì)胞代次較高，細(xì)胞老化所致，需更換代次較早的細(xì)胞。

很可能是培養(yǎng)體系不適合細(xì)胞(未使用推薦的培養(yǎng)體系);或者消化過度，對(duì)細(xì)胞有嚴(yán)重影響;或者是傳代比例不合適(具有密度依賴性的細(xì)胞，傳代太稀;或者生長較快的細(xì)胞，傳代較密，細(xì)胞嚴(yán)重堆疊生長)。

細(xì)胞增殖變慢有以下原因：1. 消化過度 2. 傳代過密 3.細(xì)胞營養(yǎng)不良 4.細(xì)胞頻繁傳代 5.細(xì)胞狀態(tài)不佳或老化 6.細(xì)胞存在污染。

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7 g時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10% CO2;當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5 g時(shí)，則應(yīng)使用5% CO2培養(yǎng)細(xì)胞。

定期(每周一次)更換水盤里面的水，水盤的水必須使用無菌蒸餾水或無菌去離子，水盤中可添加1%硫酸銅以預(yù)防霉菌污染。

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長的一個(gè)重要原因。按照我們的經(jīng)驗(yàn)：一般倍增時(shí)間24 h內(nèi)的細(xì)胞，傳代比率1:6-1:12為宜，倍增時(shí)間24-48 h的細(xì)胞，傳代比率1:3-1:8為宜，倍增時(shí)間超過48h的細(xì)胞, 傳代比率1:2-1:4為宜。

首先肉眼觀察培養(yǎng)液是否變渾濁，如果變渾濁，基本可以確定是污染;如果肉眼觀察培養(yǎng)液沒有變渾濁：在顯微鏡下觀察黑點(diǎn)大小和形狀是否規(guī)則，是否運(yùn)動(dòng)，是做布朗運(yùn)動(dòng)還是呈直線型快速移動(dòng)。如果黑點(diǎn)大小不規(guī)則，做布朗運(yùn)動(dòng)，黑點(diǎn)可能是細(xì)胞碎片(可能是細(xì)胞狀態(tài)不佳或者消化過度引起的)，也可能是血清反復(fù)凍融產(chǎn)生的蛋白沉淀引起的，也可能是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物。如果黑點(diǎn)大小一致，快速移動(dòng)，很可能是細(xì)菌污染。

掌握細(xì)胞傳代的最佳時(shí)機(jī)，不要細(xì)胞長老了再傳代;掌握好消化時(shí)間，防止消化過度產(chǎn)生細(xì)胞碎片;減少血清等試劑的凍融次數(shù);將培養(yǎng)液的PH調(diào)到最佳;嚴(yán)格控制水質(zhì)和器皿的清潔。

如果判定黑點(diǎn)是污染，請(qǐng)及時(shí)將細(xì)胞處理后丟棄。其他情況，可參照以下進(jìn)行：

如果是懸浮細(xì)胞：收集細(xì)胞上清慢速離心(500-600 rpm/min，5-6 min)并更換新的培養(yǎng)瓶;如果是貼壁細(xì)胞：將細(xì)胞用PBS洗2-3遍，洗的時(shí)候，輕輕拍打培養(yǎng)瓶，讓貼壁不牢的碎片和顆粒脫落，再棄去PBS，消化時(shí)先加低濃度的胰酶如0.05%胰酶消化1 min左右，讓細(xì)胞間隙中的顆粒和碎片脫落下來，去掉低濃度胰酶，然后正常消化細(xì)胞，將收集的細(xì)胞懸液慢速離心(500-600 rpm/min，5-6 min)并更換新的培養(yǎng)瓶，并可以嘗試適當(dāng)增加血清濃度進(jìn)行培養(yǎng)。

不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，雖對(duì)大部分細(xì)胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長差異。