怎么處理植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的各種污染

1. 培養(yǎng)基的配制注意事項(xiàng)

植物組織培養(yǎng)經(jīng)常用到 MS 培養(yǎng)基，包含十幾種化合物。因?yàn)橛行┗衔锵嘤鰰l(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，準(zhǔn)備 MS 培養(yǎng)基需要配制多種高倍母液。且配制母液時，尤其涉及大量元素的母液時，一定要等一種成分溶解之后，再緩慢的添加另一種成分，切記「一鍋煮」，即不能將各種化合物一齊添加進(jìn)去。可選用MS 培養(yǎng)基基鹽在自行加入蔗糖和瓊脂配制 MS 培養(yǎng)基，既經(jīng)濟(jì)，更高效。

2. 滅菌后培養(yǎng)基不凝膠或者凝膠偏軟

植物凝膠、瓊脂都對酸性條件敏感，pH 值低于 5 很難成膠或凝膠偏軟，切記高壓滅菌前調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 pH 值（5.5 - 6.0）。植物凝膠對二價陽離子濃度有要求，也就是相對于 MS 培養(yǎng)基，1 / 2MS 培養(yǎng)基中植物凝膠要適當(dāng)增加用量。另外滅菌后，倒出培養(yǎng)基前一定將培養(yǎng)基搖勻（帶防燙手套），因?yàn)槭黔傊芏却蟮讓雍扛?，容易造成培養(yǎng)基強(qiáng)度不均勻。選擇 Coolaber 改良 MS 培養(yǎng)基（PM10121，pH5.8±0.2）含蔗糖和瓊脂/植物凝膠，可以省去調(diào) pH 步驟。

3. 水解酪蛋白有酸水解和酶水解之分，在使用過程中有無區(qū)別？

水解酪蛋白對胚狀體、不定芽的分化有良好的促進(jìn)作用，通常用量在 500 mg/L，不管是酸解還是酶解，作用都是一樣的，酶解更有利于發(fā)揮其作用。

4. 怎么溶解組培常用植物激素？

IAA、IBA、GA、玉米素、多效唑等應(yīng)先溶解于少量 95% 的乙醇中，再加水定容配制成母液；如有結(jié)晶析出，可考慮用 1 / 10 體積的乙醇溶解后再定容；2，4 -D 易溶于堿性水溶液，可用少量 1mol/L 的 NaOH 溶液溶解后再慢慢加水定容；KT 和 6 -BA 先用少量的 HCL 溶解，再加水定容到一定的濃度。

5. 細(xì)胞分裂素使用濃度？

一般情況下在培養(yǎng)基中加入 0.1～10.0 mg/L 的細(xì)胞分裂素（6 -BA/KT/ZT)，多數(shù)用 1.0～2.0 mg/L，KT 濃度為 0.5～2 mg/L，這個也要根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料來調(diào)整。細(xì)胞分裂素可以單獨(dú)使用也可以與細(xì)胞生長素配合使用。

6. 哪些植物激素能高壓滅菌，哪些不能高壓滅菌。

IBA、NAA、6 -BA、2,4 -D 可高溫高壓滅菌。 IAA、GA3、茉莉酸等不可高溫高壓滅菌，否則會分解失效，該類植物激素配制母液后需用 0.22 微孔濾膜過濾除菌，待培養(yǎng)基冷卻（50 - 60℃）后尚未凝膠前加入混勻。

7. 培養(yǎng)基的 pH 值會凝膠硬度有無影響。

有影響。若將培養(yǎng)基 pH 值調(diào)的過高（大于 6），則培養(yǎng)基偏硬，增加接種的阻力，會對外植體造成損傷。若將培養(yǎng)基 pH 值調(diào)的過低（小于 4.5），則培養(yǎng)基不能凝固，起不到固定外植體的作用。一般將培養(yǎng)基的 pH 調(diào)節(jié)至 5.5～6.0 為宜。

8. 滅菌過程會否影響培養(yǎng)基的 pH 值？

培養(yǎng)基中的蔗糖和激素在高溫滅菌過程中容易酸化，培養(yǎng)基 pH 值滅菌后會有所下降，滅菌前培養(yǎng)基的 pH 值偏低可能導(dǎo)致培養(yǎng)基不凝或偏軟。要求偏酸性的培養(yǎng)基可適當(dāng)增加瓊脂或植物凝膠的用量。

9. 應(yīng)用 75% 的酒精進(jìn)行種子消毒的過程中需要注意的問題

種子在消毒過程中使用 75% 的酒精使用應(yīng)慎重，酒精滲透力強(qiáng)，消毒時間過長會直接影響種子發(fā)芽率，所以建議消毒時間不應(yīng)超過 1 min。

10. 原始繁殖材料的消毒

組培中，作為原始繁殖材料的外植體消毒，直接影響整個培養(yǎng)過程的進(jìn)行。從室外采回來的外植體需進(jìn)行消毒，首先用自來水沖洗外植體，沖洗時間可根據(jù)采集部位不同而定，一般在 5～15 分鐘即可；關(guān)鍵在于在超凈臺中進(jìn)行藥劑的處理，常用的藥劑處理有 70% 的乙醇溶液、9% 的次氯酸鈉溶液、和 0.1～0.2% 的升-汞溶液，具體可根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料而定。應(yīng)注意的是經(jīng)升-汞滅菌的外植體必須用無菌水沖洗 6～8 次。

11. 怎么處理植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的各種污染？

植物組織培養(yǎng)過程中的污染來源主要分為 3 種，真菌、細(xì)菌和組織培養(yǎng)過程中的污染源。在操作過程中，難免有菌落入培養(yǎng)基或植物材料上，而導(dǎo)致污染。另外，不正確操作也會增加污染機(jī)率。預(yù)防措施：通風(fēng)，保持室內(nèi)空氣干燥，紫外殺菌等。污染物品和污染培養(yǎng)基不要在培養(yǎng)室近距離開瓶洗刷。

污染原因判斷：

培養(yǎng)基污染：若污染菌類是零星分散在培養(yǎng)基中，則可確定是人為引起的污染。比如培養(yǎng)基滅菌不干凈，開瓶時間過長，滅菌后存放時間過長等； 高溫蒸汽滅菌器的溫度、壓力、時間沒有正確設(shè)置；過濾滅菌過程中濾膜孔徑選擇、過濾滅菌器的滅菌處理、過濾滅菌操作等均會影響培養(yǎng)基的滅菌效果。

措施：嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)要求，滅菌規(guī)程操作。

外植體污染：若污染菌類是從材料周圍長起，且發(fā)生在 5 天以后，則說明是材料帶的內(nèi)生菌?？赡苁墙臃N用具滅菌不干凈，接種時材料被污染；若從培養(yǎng)基以下開始長菌，發(fā)生時間較早，且有從里向外的趨勢，則說明是切口引起的污染，原因可能是未剪去兩個切口或者雖剪去切口但是所用器具帶菌；或者是未及時發(fā)現(xiàn)污染苗，接種過程中引起交叉污染；

措施：取材時應(yīng)仔細(xì)選擇，以減少污染的發(fā)生。

操作環(huán)節(jié)污染：接種室是否清潔、干燥、密封，是否經(jīng)常用紫外燈照射、甲醛熏蒸、70% 的酒精噴霧殺菌等；超凈工作臺擺放物品雜亂，長時間不換濾網(wǎng)，導(dǎo)致凈化能力降低；接種用具滅菌不干凈引起污染；操作不正確等。

措施：每次接種前半個小時，用 20% 的新潔爾擦洗室內(nèi)設(shè)備、工作臺面，再用紫外燈照射 20 min。還可以噴灑 70% 的乙醇進(jìn)行消毒。除了培養(yǎng)基、接種材料、器具和用具保證無菌外，同時在接種時還需要嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作。

出現(xiàn)污染后處理措施：

• 真菌污染后，如果已形成孢子，則必須經(jīng)高壓滅菌后扔掉；若使細(xì)菌污染，只要及時發(fā)現(xiàn)，將材料上部未感染菌的部分剪下轉(zhuǎn)接，材料仍可以用。

• 用抗生素等殺菌藥劑的處理。但至今還未發(fā)現(xiàn)哪種抗生素能夠?qū)Ω鞣N菌都有效，并且常常也會影響植物材料的正常生長分化。另一些藥劑，雖有的殺菌效果好，但往往容易引起鹽害，也無法利用。

12. 外植體的選擇

為了使接種后的誘導(dǎo)得以成功，選擇的外植體應(yīng)該是幼嫩的，處于生長旺盛時期的，而且選擇的外植體的體積不能過小，如若過小則會影響愈傷組織的形成，從而影響進(jìn)一步的分化。因此，一般接種的外植體體積在 0.5～1.0 cm2 的范圍內(nèi)即可。最適的為莖尖、帶芽莖段，也可以利用葉子、子葉、根段、花器官組織等。

13. 植物莖段組織培養(yǎng)需要注意哪些問題

以莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)比較容易，一般取植物的嫩莖切段作為外植體，切成 0.5～1 cm 長的小段進(jìn)行接種，保證每個莖段有一個芽點(diǎn)和一片葉子，將芽點(diǎn)部位以下垂直插入培養(yǎng)基凝膠中進(jìn)行生根培養(yǎng)。

14. 外植體接種需要注意的操作事項(xiàng)

接種前首*行滅菌消毒，接種所用的鑷子、解剖刀、剪刀等工具需要提前高溫高壓滅菌，提早 10 分鐘打開超凈工作臺，滅紫外 15～20 min，操作人員要用 75% 的酒精棉球擦手、工作臺和器皿，解剖刀和鑷子等隨時擦酒精灼燒，晾涼后備用。在無菌培養(yǎng)皿中或?yàn)V紙上切割外植體，接種到培養(yǎng)基表面，注意瓶口傾斜接近酒精燈火焰。

15. 組織培養(yǎng)中材料褐化現(xiàn)象

不同品種以及生理狀態(tài)引起的褐化狀態(tài)不同。培養(yǎng)基過高濃度的無機(jī)鹽及高水平細(xì)胞分裂素會使褐化現(xiàn)象加重。培養(yǎng)條件不當(dāng)，例如光照過強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加重外植體的褐變程度。

防治措施：選擇合適的外植體。選擇生長處于旺盛的外植體，可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。合適的培養(yǎng)條件，無機(jī)鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、適宜溫度、及時繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。使用抗氧化劑，在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸、PVP 等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外使用 0.1%～0.5% 的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。連續(xù)轉(zhuǎn)移，對容易褐變的材料可間隔 12～24 小時的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理 7～10 天后，褐變現(xiàn)象便會得到控制或大為減輕。

16. 材料玻璃化問題

植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明狀，呈水跡狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥，試管苗生長緩慢、玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，繁殖系數(shù)有所下降。當(dāng)培養(yǎng)基上細(xì)胞分裂素水平較高時，容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。愈傷組織的玻璃化問題主要表現(xiàn)在培養(yǎng)過程中愈傷組織松散，脆易碎。葉子或是長出的愈傷一段時間后在其周圍出現(xiàn)水漬化，繼而影響整個培養(yǎng)基。

防治措施: 在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質(zhì)，降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量及含氮化合物的用量，選用低 NH4 +水平的 B5 培養(yǎng)基，都能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生。增加光照，對減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用；在培養(yǎng)基中添加活性炭、馬鈴薯汁、間本三酚等可有效的減輕和防止玻璃化。

17. 材料水浸狀、變色、壞死、莖斷面附近干枯

可能原因：表面殺菌劑過量，消毒時間過長，外植體選用不當(dāng)（部位或時期）。

改進(jìn)措施：調(diào)換其他殺菌劑或降低濃度，縮短消毒時間，試用其他部位，生長初期取材。

18. 材料長期培養(yǎng)幾乎無反應(yīng)

可能原因：培養(yǎng)基不適合，生長素的選擇和用量不當(dāng)，植物激素對生長發(fā)育和生理過程的調(diào)節(jié)作用，往往不是某一種植物激素的單獨(dú)效果。環(huán)境溫度不適宜。

改進(jìn)措施：更換培養(yǎng)基或調(diào)整培養(yǎng)基成分，尤其是調(diào)整鹽離子濃度；調(diào)整激素的種類與配比，增加生長素用量，例如使用人工合成的生長素類似物 2，4 -D 等可有效促進(jìn)細(xì)胞分裂和伸長，新器官的分化和形成；調(diào)整培養(yǎng)溫度等環(huán)境條件。

19. 愈傷組織生長過旺疏松

可能原因： 由于培養(yǎng)基中激素添加過量，培養(yǎng)室溫度偏高，礦物質(zhì)等無機(jī)鹽含量不當(dāng)?shù)纫蛩匾鸬摹?/p>

改進(jìn)措施：根據(jù)不同的品種、不同組織、不同器官，應(yīng)適當(dāng)減少激素用量，適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整無機(jī)鹽（尤其是銨鹽）含量，適當(dāng)提高瓊脂用量增加培養(yǎng)基硬度，避免愈傷組織生長過旺和疏松現(xiàn)象發(fā)生。

20. 愈傷組織生長緩慢太緊密

可能原因：細(xì)胞分裂素和生長素的用量過多，糖濃度過高。

改進(jìn)措施：減少細(xì)胞分裂素用量，調(diào)整細(xì)胞分裂素與生長素比例，降低糖濃度。

21. 愈傷組織分化率低，畸形，分化出的芽多為葉狀芽或叢芽，芽生長困難，不易成苗。培養(yǎng)時間長時，再次愈傷組織化

可能原因：生長素用量偏高，溫度偏高。

改進(jìn)措施：減少生長素用量，可以通過分化培養(yǎng)時在培養(yǎng)基中添加 GA3（濃度在 0.5～2 mg/L 之間）解決，并適當(dāng)降低愈傷組織的培養(yǎng)溫度。

22. 叢生苗過于細(xì)弱，不適于生根或移栽

可能原因：細(xì)胞分裂素濃度過高或赤霉素使用不當(dāng)，產(chǎn)生過多的不定芽；溫度過高，光照短，光強(qiáng)不足；不及時的轉(zhuǎn)移和分切，生長空間小。

改進(jìn)措施：減少細(xì)胞分裂素用量，免用赤霉素；延長光照時間，增強(qiáng)光照；及時轉(zhuǎn)接；降低接種密度；更換透氣的封口膜等。

23. 組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)黃化

引起黃化的主要原因是培養(yǎng)基中 Fe 的含量不足，各種礦質(zhì)營養(yǎng)不均衡；培養(yǎng)環(huán)境通氣不良，瓶內(nèi)有害氣體積累（乙烯、氨氣、甲醛）等會引起植物材料黃化脫落；激素配比不當(dāng)；糖用量不足或長時間不轉(zhuǎn)移；pH 值變化過大；培養(yǎng)溫度不適；光照不足等。

改進(jìn)措施：改善組培條件，在配制培養(yǎng)基過程中檢查儀器設(shè)備是否準(zhǔn)確；降低組培苗的接種密度，及時轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物；使用透氣的封口膜改善瓶內(nèi)通氣狀況；適當(dāng)調(diào)節(jié) pH 值、激素配比和無機(jī)鹽濃度；控制培養(yǎng)室內(nèi)溫度，適當(dāng)增加光照。

24. LED 光源在植物組織培養(yǎng)中的選擇

光是植物生長中最重要的環(huán)境因子之一，并不是所有的光都有助于植物的光合作用。LED 光源 460nm 左右的藍(lán)光和 660nm 左右的紅光是植物最需要的光波，對植物的生長發(fā)育起著關(guān)鍵性的作用。

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