細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的操作步驟及經(jīng)驗(yàn)分享

細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是一種常用的基因傳遞技術(shù)，其中慢病毒轉(zhuǎn)染作為一種有效的手段被廣泛采用。通過(guò)慢病毒載體，可將目的基因序列穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞基因中，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)。這種轉(zhuǎn)染方法不僅能夠在多種細(xì)胞系中高效地實(shí)現(xiàn)基因傳遞，還能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)特定基因的穩(wěn)定表達(dá)，為基因功能研究和細(xì)胞工程提供了重要工具。

早在1981年，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)并研究了人類免疫缺陷病毒I型（HIV-1），從而掀開(kāi)了慢病毒作為載體的研究序幕。慢病毒（Lentivirus）載體是通過(guò)HIV-1進(jìn)行改造而得到的，其具備感染細(xì)胞的能力，包括分裂期和非分裂期細(xì)胞，同時(shí)在宿主體內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)長(zhǎng)期表達(dá)且具備較高的安全性。這種載體能夠穩(wěn)定表達(dá)外源基因，具有廣泛的感染范圍等優(yōu)勢(shì)，因此在基因過(guò)表達(dá)、RNA干擾、miRNA研究等實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用。

一、實(shí)驗(yàn)步驟

1、提前一天準(zhǔn)備細(xì)胞

在進(jìn)行轉(zhuǎn)染前一天，首先對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化處理，并將其培養(yǎng)于10厘米培養(yǎng)皿中，以確保細(xì)胞能夠充分貼壁且密度達(dá)70%-80%。隨后，將細(xì)胞置于37攝氏度、含有5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育8至24小時(shí)，待細(xì)胞全部貼壁后即可開(kāi)始進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。

2、轉(zhuǎn)染

1）轉(zhuǎn)染前，需換液，使用10毫升血清培養(yǎng)基替換舊的培養(yǎng)基。

2）制備混合物包括包裝質(zhì)粒和目的質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑；

a. 將8µg 目的質(zhì)粒和16µg 病毒包裝質(zhì)粒(psPAX2：pMD2.G=1:1)加入到1ml 無(wú)血清Opti-DMEM，充分混合；

b. 將50µl轉(zhuǎn)染試劑溶于1ml Opti-DMEM中，充分混合，靜置5分鐘；

c. 將轉(zhuǎn)染試劑稀釋液滴加入質(zhì)粒稀釋液中，邊滴加邊輕輕混合，然后在室溫下靜置20分鐘，使DNA和轉(zhuǎn)染試劑充分結(jié)合形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。取出培養(yǎng)皿，將配制好的DNA-轉(zhuǎn)染試劑混合物加入培養(yǎng)皿中，輕輕混合，標(biāo)記后放回培養(yǎng)箱中；

3）經(jīng)過(guò)6~8小時(shí)后，吸除培養(yǎng)基，用4ml PBS清洗一次，然后加入8ml 新鮮血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

3、收病毒

進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，每隔24小時(shí)將培養(yǎng)上清收集至50毫升離心管中，進(jìn)行適當(dāng)標(biāo)記，并為細(xì)胞更換新鮮的血清培養(yǎng)基。在最后一次收集病毒液后，應(yīng)將接觸過(guò)病毒的槍頭、離心管、培養(yǎng)皿等物品浸泡于84消毒液中進(jìn)行消毒處理，然后安全丟棄。

4、包裝病毒

貼壁細(xì)胞：

1）慢病毒轉(zhuǎn)染前一天，將貼壁細(xì)胞鋪到24孔板中，確保每孔約有2×10^5個(gè)細(xì)胞。第二天，在37攝氏度下使用含有6 μg/ml polybrene的2毫升新鮮培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基，并加入適量病毒懸液孵育。

2）對(duì)于polybrene毒性敏感的細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后4小時(shí)內(nèi)加入2毫升新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。

3）繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，然后用新鮮培養(yǎng)基替換含病毒的培養(yǎng)基。

4）繼續(xù)傳代培養(yǎng)，如果慢病毒含有熒光蛋白，在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)通?？捎^察到明顯的熒光表達(dá)，72小時(shí)后表達(dá)更為明顯，如果慢病毒含有抗性基因并需要進(jìn)行藥物篩選，則可在轉(zhuǎn)染3-4天后開(kāi)始添加藥物。

懸浮細(xì)胞：

1）將濃度為6 μg/ml 的polybrene加入2×10^5/ml懸浮細(xì)胞中，并加入適量病毒，充分混勻后在37攝氏度下孵育?；蛘哌M(jìn)行室溫離心，離心速度為150g，持續(xù)4小時(shí)（對(duì)于難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，可選擇此步驟以提高轉(zhuǎn)染效率）。

2）對(duì)于對(duì)polybrene毒性敏感的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后4小時(shí)，加入相同體積的新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。

3）繼續(xù)培養(yǎng)3-4天。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，可以進(jìn)行細(xì)胞傳代或者更換培養(yǎng)基

二、注意事項(xiàng)

1）進(jìn)行慢病毒相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意安全，穿實(shí)驗(yàn)服，戴口罩和手套。

2）在操作病毒時(shí)務(wù)必小心，避免產(chǎn)生氣霧或飛濺，所有接觸過(guò)病毒的工具，如槍頭、離心管、培養(yǎng)皿以及培養(yǎng)液，請(qǐng)浸泡在84消毒液中過(guò)夜后，確保全部消毒后再進(jìn)行處理。

3）病毒操作時(shí)要使用生物安全柜，如果使用普通超凈工作臺(tái)，不能打開(kāi)風(fēng)機(jī)。

4）如果加入Puromycin后觀察到細(xì)胞死亡較多，務(wù)必及時(shí)更換培養(yǎng)基，以防止死細(xì)胞釋放的有害物質(zhì)影響到具有抗性的細(xì)胞的生長(zhǎng)。

5）需注意病毒液的儲(chǔ)存方式：若在短時(shí)間內(nèi)（3天內(nèi)）需要使用，可將病毒液存放于4攝氏度的冰箱中。然而，若無(wú)法在短期內(nèi)全部使用，建議將慢病毒液分裝后置于-80攝氏度的冰箱中保存。在分裝時(shí)應(yīng)根據(jù)每次使用的量進(jìn)行，將準(zhǔn)確的病毒液分裝至凍存管中，并做好日期和儲(chǔ)存量的標(biāo)記，封口膜密封以確保密封性。病毒液在-80攝氏度的冰箱中可保存約6個(gè)月。

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