提高效率與質(zhì)量的實(shí)用技巧

1、提高實(shí)驗(yàn)的效率

1）實(shí)驗(yàn)前有計(jì)劃安排、預(yù)備方案或者“車輪戰(zhàn)"（細(xì)胞實(shí)驗(yàn)）

一般從基礎(chǔ)的培養(yǎng)細(xì)胞開始，開始實(shí)驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法一般來自于實(shí)驗(yàn)室或者文獻(xiàn)中條件優(yōu)化以及自我推測及驗(yàn)證，因此做實(shí)驗(yàn)之前預(yù)想實(shí)驗(yàn)方案有助于我們不至于“手忙腳亂"。

以實(shí)驗(yàn)前的細(xì)胞鋪板實(shí)驗(yàn)為例：

表1 常用細(xì)胞培養(yǎng)體系：

細(xì)胞鋪板的孔數(shù)一般取決于我們后期實(shí)驗(yàn)的目的，實(shí)驗(yàn)前了解各類細(xì)胞的鋪板數(shù)量以及培養(yǎng)基添加量都十分重要。以病毒或者細(xì)菌感染細(xì)胞模型來說，我們需要一個(gè)比較準(zhǔn)確數(shù)量級(jí)的細(xì)胞數(shù)目和病毒或菌液濃度得后期實(shí)驗(yàn)的MOI值，細(xì)胞計(jì)數(shù)和病毒及菌液濃度測定也很關(guān)鍵；

細(xì)胞鋪板：我們需要收集盡可能多的細(xì)胞，原因是當(dāng)我們剩余出來的細(xì)胞可用于細(xì)胞傳代繼續(xù)保留，可若是鋪板數(shù)量達(dá)不到（重新離心收集細(xì)胞浪費(fèi)時(shí)間）可能會(huì)導(dǎo)致加藥濃度過大使得細(xì)胞大量死亡而影響后期實(shí)驗(yàn)，比如你要提取RNA或者蛋白，細(xì)胞數(shù)目不足，后期的RNA濃度或者BCA測蛋白濃度的結(jié)果都不是非常理想繼而影響后面實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展。

2）具體安排（Western blot實(shí)驗(yàn)）

從試驗(yàn)干擾開始（給藥處理），根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟來講，完整的Western blot實(shí)驗(yàn)預(yù)計(jì)2-3天。

（1）以給藥時(shí)間24h為例：24h后，收集細(xì)胞提取蛋白，貼壁細(xì)胞加IP裂解液或RIPA裂解液用細(xì)胞刮板移至1.5ml離心管；懸浮細(xì)胞收集細(xì)胞至離心管離心去除培養(yǎng)基，用PBS清洗離心去除上清再加入裂解液，預(yù)計(jì)提取蛋白以及BCA測蛋白濃度一上午的時(shí)間，估計(jì)上樣體積加入loading buffer煮蛋白置于-80℃保存；下午跑蛋白電泳，SDS-PAGE膠可于前一天晚上制好防止-4℃冰箱保存（用少量純水用封裝袋保存）或使用預(yù)制膠，大概1多小時(shí)蛋白maker跑到距離膠最下面1-2cm處停止電泳；轉(zhuǎn)模，根據(jù)目的蛋白的大小確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間和毫安數(shù)，結(jié)束后裁膜用5%脫脂奶粉封閉，之后孵育一抗4℃過夜，第二天洗膜孵育二抗并進(jìn)行顯影，因此步驟時(shí)間熟練的話2天就可以完成一次WB實(shí)驗(yàn)。

（2）預(yù)備方案：實(shí)驗(yàn)重復(fù)是不可避免的，因此預(yù)備下一周期實(shí)驗(yàn)方案（車輪戰(zhàn)）有助于縮短時(shí)間提高效率，當(dāng)然，師兄師姐以及廣大學(xué)術(shù)里的經(jīng)驗(yàn)小tips也有助于提高實(shí)驗(yàn)效率。例如，在WB配制SDS-PAGE膠的凝固時(shí)間通常會(huì)隨季節(jié)溫度的變化而改變，夏季和冬季應(yīng)該時(shí)間就會(huì)產(chǎn)生差異（冬季凝固較慢），再者，AP 和TEMED 作為促凝劑，一般都是最后加入，尤其是AP（過硫酸銨）。實(shí)驗(yàn)之前我們可能都會(huì)設(shè)計(jì)一個(gè)預(yù)期結(jié)果，我們可以在上一周期實(shí)驗(yàn)的空余時(shí)間預(yù)備下一周所需要的實(shí)驗(yàn)條件，例如重新細(xì)胞鋪板給藥等待時(shí)間周期等等。

2、提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量：減小系統(tǒng)誤差，消除人為錯(cuò)誤

以qPCR為例：該實(shí)驗(yàn)檢測基因的mRNA表達(dá)水平，操作過程要求一定的準(zhǔn)確性，因?yàn)榧訕芋w系較小，各試劑的加樣量更要求精準(zhǔn)，下面是一些來自個(gè)人的小tips:

①減小系統(tǒng)誤差：一般設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)孔，但是后期我統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，誤差bar仍可能較長，這時(shí)我們可以設(shè)計(jì)4個(gè)復(fù)孔，去除一個(gè)誤差最大的值也有助于結(jié)果的準(zhǔn)確性。這時(shí)就要求我們會(huì)更加精準(zhǔn)的使用移液槍。另外，重復(fù)實(shí)驗(yàn)也有助于提高我們加樣的準(zhǔn)確性。

②制備預(yù)混液：例如我要做30(2×5×3)孔兩個(gè)基因（包含內(nèi)參），5個(gè)處理，3個(gè)復(fù)孔，那么我的熒光染料一個(gè)孔需要5ul，正反引物2ul，那么我們可以再不浪費(fèi)試劑的情況下，計(jì)算量可為:15.5×5+15.5×2或者（15×5+15×2）×1.1，這一定程度上都是為了消除我們?nèi)藶榧訕诱`差。

③另外我們盡量增大加樣體積減少誤差：針對(duì)于10ul體系，提前將正反引物混合，配制SYBY+正反引物和cDNA+ddH2O，這時(shí)的體積為6+4或者7+3可減少加樣體積小帶來的加樣誤差。

④相關(guān)試劑使用前需離心使用：另外，在八聯(lián)管上機(jī)前需要用干凈的手套蓋上透明蓋子，適當(dāng)離心將反應(yīng)體系離心至管底。

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